一文让你轻松读懂CRISPR检测技术原理

一．CRISPR检测-认识CRISPR/Cas系统

CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），即很多条相同的小段，然后把它们均匀地插入了一段杂乱排列的DNA一样。这些序列称为重复序列(repeat)，而把它们隔开的杂乱排列的DNA称为间隔序列(spacer)。而Cas的全称是CRISPR associated（CRISPR关联），简称为CRISPR/Cas系统。

CRISPR/Cas系统来源于细菌的免疫系统，在原核生物中，CRISPR-Cas系统作为免疫系统，利用CRISPR RNAs（crRNAs）作为引导分子，靶向识别入侵核酸，在抵御外来病毒入侵。

 

图1.CRISPR/Cas系统

二、CRISPR/Cas系统具体是如何来抵御外来病毒入侵的呢？

其过程主要有以下三个阶段：

1、适应阶段：将外来的病毒或噬菌体的 DNA 片段作为间隔序列（spacer）整合到 CRISPR array ；

2、表达阶段： CRISPR array 被转录为初级转录产物 pre-crRNA，pre-crRNA 被 Cas 蛋白加工产生成熟的 CRISPR RNA（crRNA）；

3、干扰阶段：成熟的 crRNA 与 Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合体，crRNA 引导 Cas 蛋白特异性靶向切割入侵者的核酸，达到免疫防御的目的。

 

图2. CRISPR-Cas 免疫涉及三个不同的机制阶段

知道了CRISPR/Cas的来源及在细菌免疫系统中发挥的作用，人们开始将此免疫系统应用在基因编辑上，那么我们再一起看一下CRISPR/Cas系统是如何应用到CRISPR检测的呢？

三．CRISPR检测原理

CRISPR检测技术所用的Cas蛋白主要有Cas12、Cas13和Cas14，与Cas9不同的是，Cas12、Cas13和Cas14除了具有特异性切割靶序列的功能外，在切割靶标序列之后，还具有非特异性切割其它核酸序列的功能（即Cas蛋白的反式切割活性）。在反式切割激活的状态下，可非特异性切割任意单链，将体系中的荧光标记探针切碎，即可用来检测信号。由此开展各种基因检测技术。

以Cas12a为例：Cas蛋白反式切割活性激活过程

Cas12a处理其自身的crRNA5’端，dsDNA靶标识别始于WED和PI结构域的PAM识别，从而促进dsDNA靶标的展开。r-环的形成是由TS结合crRNA片段而启动的。过程的crRNA-TS配对，同时TS-NTS展开导致形成完整的r-环。crRNA-TS DNA氢化诱导REC叶的构象变化，导致RuvC结构域的催化位点的变构解封。NTS结合槽引导移位的NTS向RuvC催化位点移动，导致NTS的顺式裂解。随后，进一步解开pam-远端TS-NTS双链，使TS进入RuvC催化位点，导致TS的顺式裂解。pam-远端dsDNA被释放，而PAM-近端dsDNA仍然与Cas12a-crRNA复合物结合。这使得Cas12a保持在一个催化激活的构象中，这允许非靶标ssDNA的反式裂解。主要概括为以下四个步骤：

1、Cas12a蛋白的WED和PI结构域识别dsDNA靶标的PAM序列，从而促进dsDNA靶标的展开。

2、crRNA和靶标链互补配对，和非靶标链行成R-loop环。

3、REC远离RuvC，RuvC结构域切割位点暴露，顺式切割非靶标链和靶标链。

4、PAM远端dsDNA被释放，Cas12a-crRNA复合物与近端dsDNA结合，Cas12a反式裂解被激活。

 

图3. Cas12a介导的DNA顺式和反式裂解模型图

一句话概括来说CRISPR检测就是由靶标核酸激活Cas蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成靶标核酸检测的过程。

 

  

 

我们是专注于做CRISPR检测的团队，自主研发的Cas12a蛋白，Cas12b蛋白，Cas13a蛋白活性远高于市面上其它公司，如果你也在正好在做CRISPR检测，欢迎咨询：18102225074（微信同号）。