【前沿资讯】基因编辑新动向-敲除细胞、先导编辑点突变技术照亮基因研究之路

一丶基因敲除细胞协助解密抗病毒能力的分子机制

解析多聚(A)聚合酶催化亚基与鸟苷酸结合蛋白2拮抗靶向体外病毒的抗病毒能力的分子机制。

最近猴痘病毒在人类中的传播加剧了人们对正痘病毒感染的关注。异痘病毒（ECTV）与猴痘病毒的遗传和疾病特征非常相似，是研究正痘病毒-宿主相互作用的一个有价值的研究工具。鸟苷酸结合蛋白（GBPs）是高表达的干扰素刺激基因（ISGs），对各种细胞内的病原微生物具有拮抗作用。

用含有特异性靶向PAPL基因的gRNA质粒转染到小仓鼠肾细胞（BRT17细胞），随后用表达ECTV的病毒转染小仓鼠肾细胞，经过筛选获得PAPL基因敲除的ECTV。在非洲绿猴肾成纤维细胞（CV1）中进行病毒空斑实验来评估PAPL缺失对病毒复制的影响。用缺失PAPL基因的细胞中病毒的复制能力显著降低，表明PAPL在ECTV的复制过程中发挥了不可或缺的作用。我们的研究为PAPL作为一种可与GBP2相互作用的毒力因子提供了初步证据。

图1. PAPL基因敲除导致病毒在体外复制的减少

二、CRISPR Cas9基因PKCδ敲除基因-解析新型PKC亚型在DNA完整性检查点中作用的多模型研究

蛋白激酶C（PKC）家族在许多细胞代谢过程中发挥着重要的调节作用。酿酒酵母包含一个PKC，Pkc1，而在哺乳动物中，PKC家族包含9个亚型。Pkc1和新亚型PKCδ都参与了DNA完整性检查点激活的调控，而且这种机制从酵母到哺乳动物是保守的。

采用CRISPR-Cas9技术获得了PKCδ敲除的小鼠胚胎干细胞（mESCs）。该模型表明，PKCδ的缺失降低了效应激酶CHK1的激活，然而其他亚型可能参与了这一功能。因此，研究者使用酵母来研究每个单一的PKC亚型去激活DNA完整性检查点的能力。研究者的分析发现，PKCθ最接近PKCδ的亚型，也能够执行这一功能，尽管效率较低。通过在关键残基中生成截断版本和突变版本，研究者发现了PKCδ和PKCθ的激活机制之间的差异，并确定了它们的基本结构域。该研究验证了PKC在DNA完整性检查点通路中的关键角色作用，并强调了结合不同的研究模型的优势。

图2. PKCδ在小鼠ESCs DNA完整性检查点激活中的作用分析

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三、使用先导编辑点突变技术获得FecBB and TBXT突变体绵羊和KCNJ5G151R/+点突变猪囊胚

最近出现的先导编辑器（PEs）可以实现所有可能的单核苷酸替换以及靶向插入和删除，这显示了编辑和纠正各种生物体的基因组的良好潜力。然而，将PE应用于编辑家畜基因组的研究尚未见报道。

在本研究中，研究者利用PE技术成功地产生了两个具有农业生产意义的突变绵羊，包括与繁殖力相关的FecBBp。Q249R和与尾长度相关的TBXT p.G112W。此外，研究者应用PE技术生产了一个具有生物医学相关点突变的猪囊胚(KCNJ5 p.G151R)作为人类原发性醛固酮增多症的猪模型。该研究的应用证明了PE系统在编辑大型动物基因组方面的潜力，为农场动物的初级编辑技术应用提供了适用的参考。