【干货分享】CRISPR系统如何识别自身与外源DNA？
在进行CRISPR相关研究时，你是否有过这种疑问：PAM序列只是几个碱基重复，如Cas9识别5’-NGG-3’，这种序列重复并不少见，细菌自身肯定也含有很多类似的重复，那为什么CRISPR系统不会识别自身基因组来截取protospacers？这篇题为CRISPR adaptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA的文章或许能给我们一些启发。
为验证Cas1、Cas2与间隔序列获取的关联性，作者进行了以下实验：设置添加0.2%阿拉伯糖组两个重复，不添加阿拉伯糖组两个重复，并设置对应的空载体空白对照组各两个重复，在16小时培养后测序，观察CRISPR序列是否增加新的间隔序列。结果显示，添加了阿拉伯糖组有36.92%的CRISPR序列产生新的间隔序列，未添加阿拉伯糖组只有2.61%的CRISPR序列产生新的间隔序列，空白对照组均无产生新的间隔序列，该实验结果表明Cas1和Cas2的表达显著增加了新间隔序列的产生。未添加阿拉伯糖组有少量新增间隔序列可能是由于Cas1-Cas2转录的泄漏导致。
图1-a 验证Cas1、Cas2与间隔序列获取的关联性实验
为检测新间隔序列的来源，作者在以上实验的基础上进行高通量测序，发现添加0.2%阿拉伯糖组有22.86%的间隔序列来自自身染色体，未添加阿拉伯糖组有1.8%的间隔序列来自自身染色体，表明新间隔序列大部分来自于外源质粒DNA，少部分来自自身染色体，且Cas1和Cas2不表达或低表达将导致CRISPR系统获取间隔序列时对外源DNA有更高特异性。
图1-b 检测新间隔序列来源实验
为进一步了解Cas1和Cas2从细菌DNA获取间隔序列的机理，作者通过大量的间隔序列测序来检查间隔序列获取的染色体尺度模式。从图2-b上可观察到PAM在染色体上分布均匀，说明PAM是普遍存在的，而原间隔序列的密度却存在偏差。从图a上可观察在染色体起源（oriC）和染色体复制末端（Ter）以及CRISPR所在序列三个区域上原间隔序列密度最大，其中Ter区更为明显。Ter是染色体上相反两个复制叉相遇的位置，TerA和TerC是单向分叉停止位点，这些位点能使先到达Ter的复制叉停止，直到另一边的复制叉到达。大肠杆菌中顺时针复制体(oriC到TerA)比逆时针复制体(oriC到TerC)长，导致复制叉在TerC时比在 TerA时更容易自然停止，由此产生TerC/TerA偏差。此外，Ter位点附近的原间隔序列热点相对于复制叉的前进方向来说是不对称的，从图c可以看出，在每个复制叉停滞位点的上游观察到很强的原间隔序列富集，而在复制叉停滞位点的下游观察到相对较低的原间隔序列密度。至于为什么会产生这种现象，作者在后续研究中会讲到，这个问题先暂时放一放。最后图d中作者将一个天然Ter位点B结合到染色体上的pheA 位点上，产生了一个新的局部原间隔序列热点，有力的证明了原间隔序列的获取与复制叉的停滞相关联。
图2 间隔序列获取的染色体尺度模式
图3-a中大肠杆菌 BL21-AI在CRISPRⅠ上游有明显原间隔序列热点，而CRISPRⅡ上游没有。因为大肠杆菌 BL21-AI缺少先导序列，不能积极主动的进行适应阶段，只能依靠pCas1+2中的Cas1和Cas2整合，从图3-b中可以看出正常大肠杆菌K-12中两个位点上都是有活性的。作者根据先前实验推测CRISPR阵列上原间隔序列的密集可能会像TerA和TerC一样导致复制叉停滞，这可能是导致TerC原间隔序列密度更高的原因之一。
图3 大肠杆菌BL21-AI、K-12间隔序列获取热点
作者假设DNA的复制可能促进了CRISPR系统的适应阶段。为了验证假设，作者在图1-a的基础上额外做了两组实验，第一组添加药物萘啶酸，该药物能抑制 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 IV 的亚基从而抑制DNA复制，第二组添加RNA聚合酶抑制剂利福平，该药物能阻断转录过程（但不影响T7 RNA 聚合酶对Cas1、Cas2的转录）。结果显示，抑制DNA复制后新增间隔序列的数量几乎为0，抑制转录则新增间隔序列的数量有所减少，但还比较高，由此证明间隔序列的获取主要在DNA复制过程进行。
图4 DNA的复制促进CRISPR系统适应的验证实验一
作者还做了另一个实验来进一步验证上面的假设：作者选用带有温度敏感基因dnaC2的大肠杆菌K-12细胞和野生型细胞进行实验，C2基因使细胞在30摄氏度下能正常复制，而在39摄氏度下复制被阻断。结果显示，30摄氏度下两组都能检测到一定数量的新增间隔序列，而39摄氏度下含温度敏感基因dnaC2的K-12细胞几乎检测不到新增间隔序列，不含温度敏感基因的K-12细胞检测到新增间隔序列。
图5 DNA的复制促进CRISPR系统适应的验证实验二
为探究间隔片段获取偏好是否与复制叉的位置相关，作者将温度敏感的dnaC2细胞的培养物转移到39摄氏度中70分钟，在该温度下DNA复制的重新启动被抑制，细胞中所有DNA都不含有复制叉。接着诱导Cas1、Cas2表达30分钟，并将培养物转移到30摄氏度，使复制同步开始。在这些条件下，复制叉在dnaC2细胞中完成一个完整的DNA复制周期平均需要60分钟左右，在同步复制启动后的20、40、60、90和120分钟对新获得的间隔序列进行了测序，发现随着复制周期的推进，来自Ter区的间隔片段的比例逐渐增加，在60分钟时到达顶峰，往后新复制周期开始再循环往复。该实验结果证明在DNA复制过程中，Cas1、Cas2复合体倾向于从停滞的复制叉区域获取间隔序列。
图 6 间隔片段获取偏好与复制叉位置关联性实验
讲到这你可能就明白了，外源质粒因为复制频率高，有大量复制叉，而DNA复制时容易出现双链断裂，所以也很容易被CRISPR系统截取。而细菌基因组正常情况下没有大量暴露的双链DNA末端，所以被截取的概率小得多。但在复制过程中出现双链DNA断裂时，也有一定机会被CRISPR系统截取。
回归到之前遗留的问题：为什么在每个复制叉停滞位点的上游观察到很强的原间隔序列富集，而在复制叉停滞位点的下游观察到相对较低的原间隔序列密度？作者在实验中发现在停滞位点下游原间隔序列都被八聚体GCTGGTGG环绕，而这段序列是Chi位点的经典序列。
在讲解Chi位点之前首先要讲一下大肠杆菌的RecBCD机制。RecBCD是大肠杆菌另外一种免疫机制，同时是自身染色体DNA同源重组修复机制的一部分，当双链 DNA断裂时，RecBCD定位在暴露的末端，解旋并降解DNA，直到RecBCD识别到Chi位点后，RecBCD停止降解DNA，转而开始进行DNA的修复。
图7 RecBCD机制
一般外源噬菌体的DNA本身就是线性的，有暴露的双链DNA末端，所以容易在RecBCD降解它的过程中被Cas1/2复合体截取原间隔片段；外源质粒因为复制频率高，有大量复制叉，而DNA复制时容易出现双链断裂，所以也很容易被CRISPR系统截取。而细菌在复制过程中在复制叉停滞位点易出现DNA断裂，Cas1、Cas2在dsDNA断裂的加工过程中从RecBCD降解的中间体中获得间隔序列，而一旦RecBCD遇到Chi位点，DNA断裂停止，CRISPR系统就无法获得间隔序列，这解释了为什么复制叉停滞位点的上游观察到很强的原间隔序列富集，而在复制叉停滞位点的下游观察到相对较低的原间隔序列密度。此外，细菌的Chi位点是普遍且密集存在的，这使CRISPR系统从细菌DNA断裂上获得间隔序列的可能性大大减小，远不如从噬菌体或外源质粒上获取间隔序列的可能性高。
图8 RecBCD工作机理
作者为了进一步测试间隔序列的获取是否确实依赖于RecBCD复合物的活性，使用分别删除了recB、recC和recD的大肠杆菌菌株培养16h后测序，发现所有这些缺失菌株的间隔序列获取率都有所降低。与野生型菌株相比，recB、recC和recD缺失菌株中来自自身染色体间隔序列的比例升高。结果表明，RecBCD的活性对间隔序列的获取有所影响。
图9 间隔序列获取与RecBCD复合物活性关联性实验
综上所述，作者证明Cas1/Cas2对原间隔片段的获取依赖于DNA双链断裂和降解，Cas1/2复合体从RecBCD降解双链DNA的中间产物中获取原间隔片段，而细菌DNA中密集的Chi位点使RecBCD降解DNA产生中间产物的数量远不及RecBCD降解外源质粒和噬菌体的产物，Cas1/2获取的间隔序列仍主要以外源质粒和噬菌体为主。
艾迪基因专注CRISPR/Cas9技术底层研发，建立了CRISPR-EDITx™技术平台和Bingo™先导编辑点突变平台，面向国内外各科研院所和医药企业提供CRO服务（细胞基因敲除、基因过表达、基因点突变和CRISPR文库筛选等），促进CRISPR/Cas技术更好的应用。
18102225074（微信同号）
market@edgene.cn
最近资讯
【前沿资讯】基因编辑新动向-敲除细胞、先导编辑点突变技术照亮基因研究之路
【艾迪大讲堂】如何检测基因敲除细胞系的编辑效率？