Prime editing 101：一文带你读懂先导编辑
Prime editing是David R. Liu团队在2019年提出的全新基因编辑技术，在没有DSB和供体DNA模板的情况下可介导靶向插入、缺失以及十二种碱基替换，实现精准基因编辑。这四年间Prime editing发展迅速，在各个领域都展现出了巨大潜力。
Prime Editing原理
Prime editing使用由引物编辑引导RNA（Prime editing guide RNA，pegRNA）和nCas9组成的复合物。PegRNA可分为5’端的guide RNA、中间的Cas9结合区域以及3’端的PBS（Prime-binding site）；nCas9为具有单链切割活性并融合了M-MLV逆转录酶的Cas9 nickase。
复合物通过pegRNA引导下识别PAM并结合与guide RNA互补的目标DNA链，Cas9酶切割PAM上游原始间隔序列第3和第4个核苷酸之间产生一个切口；断裂的DNA单链与PBS结合，逆转录酶生效，沿着PBS进行逆转录，生成编辑序列；编辑序列与目标DNA原序列会竞争性与另一条链通过碱基互补配对结合，未结合的序列则会翘起来，最后被切除。
竞争性结合最后会产生两种结果：一种是目标DNA原序列留下，编辑序列被切除，此时目标DNA未被成功编辑，可能会再次被复合物再次识别；另一种是编辑序列留下，目标DNA原序列被切除，此时由于编辑后序列与另一条链序列不匹配，编辑位点形成突起，细胞内DNA错配修复机制进行修复。而修复的结果也分为两种，分别是编辑位点被修改，回归目标DNA最初始的状态；以及另一条链被修复，生产编辑后的DNA双链，成功达到精准基因编辑的目的。
首批Prime Editing数据公布
2023年10月27日，Prime Medicine首席科学主任Jeremy S Duffield博士在布鲁塞尔的欧洲基因和细胞治疗学会上以Prime editing precisely corrects prevalent pathogenic mutations causing Glycogen Storage Disease Type 1b (GSD1b)为题进行了汇报。
糖原贮积病（GSD）是一组因糖原分解或合成酶缺陷引起的遗传代谢病，其葡萄糖-6-磷酸转位酶（G6PT）的SLC37A4基因突变导致GSDⅠb型的发生，在空腹状态下无法产生葡萄糖，引起低血糖发作及相关癫痫发作，并引起以中性粒细胞减少和髓系功能障碍为特征的免疫紊乱，在人群中50%的GSD1b患者人群的SLC37A4基因突变为p.L348fs和p.G339C。Prime Medicine最新研发数据表明其生产的Prime Editors在人源化小鼠中精确纠正了1b型糖原贮积病p.L348fs突变，全肝精确校正率超过56%，G6PT基因的精确编辑恢复了G6PT蛋白的表达；在大型动物食蟹猴肝脏中高效、准确地编辑SLC37A4 (G6PT)基因p.L348，全肝精确编辑高达50%且食蟹猴耐受性良好。
Prime Editing的发展
最初的Prime editing系统被称为PE1，其编辑效率并不算高，还可能存在非特异性编辑；后来为提高Prime editing系统编辑效率，开发出一系列优化后的系统。
PE2：在M-MLV逆转录酶中引入数个突变，使逆转录酶在高温条件下有更好的逆转录活性，并与pegRNA结合更紧密，最终其编辑效率为PE1的1到5倍。
PE3：加入新的sgRNA引导Cas9切割DNA，理想条件下能识别到被Prime editing编辑过但还未被DNA错配修复机制修复的DNA，指导Cas酶在与编辑位点互补的DNA链上切割，提高编辑效率，但实际上往往在DNA双链都产生切口，诱发DNA双链修复机制，引入indel。
PE3b:重新设计新加入的sgRNA，将编辑序列加入到sgRNA中，达到理想条件，使DNA错配修复机制修复与编辑位点互补的DNA链。
PE4、PE5：研究发现DNA进行错配修复时PE的编辑效率会降低，并刺激indel的产生。PE4（PE5）是在PE2（PE3）的基础上，短暂表达一种显性功能缺失（dn）的蛋白MLH1dn，该蛋白在羧基端的最末端缺少三个氨基酸，使其失去核酸内切酶的功能，瞬时抑制错配修复酶的活性。
PEmax：在PE2的基础上进行一系列改良优化，如优化逆转录酶密码子、在SpCas9中一些氨基酸突变以提升酶切效率、在整个酶两端加入NLS肽段以增加复合酶对核酸的吸附力等，这些优化使PEmax相比PE2在Hela细胞中的编辑效率提高了2.5倍，在HEK293T细胞中提高了1.2倍。
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Prime Editing的应用
目前Prime editing已被广泛用于治疗各种疾病的研究，
在苯丙酮尿症(PKU) Pahenu2小鼠模型上，利用人腺病毒载体5 (AdV)将PE3ΔRnH传递给Pahenu2小鼠模型，平均校正效率为11.1%且未检测到脱靶突变或其他肝脏炎症，表明prime editing系统在PKU的临床治疗中发挥作用；
对人类Leber先天性黑蒙(LCA)小鼠模型注射分裂的aave - pe2以修复RPE65外显子3的无义突变（C→T），平均编辑效率为28%，未产生意外编辑；
使用Prime editing系统将2个碱基插入ΔEx51 iPSC模型的第52外显子,以治疗杜氏肌肉营养不良症（DMD），其编辑效率高达54%。
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从基因水平“对症下药”，精准治疗由indel导致的“疑难杂症”，Prime Editing凭借其精准、高效的基因修复特性，为定制化基因疗法提供了可行性。随着技术的不断改进和完善，Prime Editing有望成为未来基因治疗和精准医学的重要工具，为人类健康带来新的希望。
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