【前沿资讯】新的DNA依赖型基因编辑技术可能改变Prime editing的模板

Prime editing是最新的基因编辑方式之一，它可以在不产生双链断裂的情况下对DNA进行精确编辑。但它的效率、适应性和准确性存在局限性，这是科学家们在过去五年中一直试图解决的问题。例如，用于引物编辑的pegRNA分子化学合成困难且昂贵，克隆也很费力，这阻碍了对引物编辑效率的关键优化。此外，用于启动编辑的逆转录酶(RT)酶相对容易出错，并且具有较低的处理能力，这可能会限制可以引入的编辑的精度和大小，影响非分裂和分化细胞中的引物编辑效率。

为了解决这些问题，由麻省总医院(MGH)和哈佛医学院的Ben kleinver博士和RNA治疗研究所(UMass Chan医学院)的Erik Sontheimer博士领导的两个研究小组独立开发了新的方法，通过用另一种类型的酶(即DNA依赖性DNA聚合酶)取代RT来构建启动编辑。这种变化允许使用DNA而不是RNA作为编辑模板，通过提高效率和适应性，潜在地解决了初始编辑的一些主要限制。MGH和哈佛医学院的kleinver小组将其新技术称为“click editing”，该技术最近在BioRxiv的预印本中进行了描述。该论文的第一作者之一费雷拉·达·席尔瓦博士说：“我们开发了一种新的DNA书写酶结构，它利用了DNA依赖的DNA聚合酶的有利酶特性，以及优化的便利性、制造的可扩展性和分离DNA模板的化学稳定性。”

RNA治疗研究所的Sontheimer博士的研究小组在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)的一篇文章中发表了他们的发现，他们在文章中报告了一种类似的技术，称为DNA聚合酶编辑(DPE)。Sontheimer博士说:“通过使用DNA聚合酶，该系统提高了初始编辑的保真度，并可以延长我们能够进行的编辑的长度”

使用DNA聚合酶和DNA模板进行基因编辑

如上所述，这两个研究小组着手解决相同的问题，并且都合理地认为，用依赖DNA的DNA聚合酶取代prime editors的RT成分将提供显着的优势。RTs中有些内容并不符合我们的要求。我们的prime editors在保真度、处理能力和dNTP亲和力方面没有我们想要的那么好。我们知道，在这方面，有许多依赖DNA的DNA聚合酶要优越得多”Sontheimer博士解释说。事实上，DNA依赖性DNA聚合酶(DDP)的dNTP亲和力增加表明，dNTP在更广泛的细胞类型中具有更高的活性，包括非分裂和分化细胞，其中dNTP的可用性最近被证明限制了prime editing。

第二步是将编辑模板从gRNA中分离出来，从而消除了合成长pegRNA的需要。然而，这需要模板以另一种方式绑定到编辑复合体。Sontheimer小组决定通过将DDP融合到MS2外壳蛋白(MCP)上来解决这个问题，MCP能够识别模板内的MS2茎环RNA结构域并将其结合。这意味着它们的模板必须至少部分由RNA构成。

寡核苷酸治疗领域多年来一直在制造DNA-RNA杂交体。例如，许多进入临床开发的反义寡核苷酸，例如用于RNAi治疗的sirna，都是类似的嵌合分子，其中可以有一些RNA残基，一些DNA残基，甚至一些2'-甲基核糖或2'-氟核糖残基。“当你通过固相合成来构建你的分子时，有一个完整的化学宇宙可以使用”Sontheimer博士解释说。

他们设计的杂交模板（以下称为DNA聚合酶编辑模板，dpet)维持了通过MCP结构域将其与聚合酶连接所必需的RNA MS2茎环。然而，编码所需编辑的聚合酶模板区域是用DNA残基制成的。“我们意识到我们可以通过化学合成使模板更稳定，我们可以做的一件事就是改变模板区域本身的性质，不再依赖RNA作为模板，而是使用DNA代替，”Sontheimer博士说，“与pegRNAs相比，这是一个很大的优势，因为当你加入更少的RNA残基时，合成和纯化的效率可以大大提高。”

寻找缺失的部分：如何将DNA分子与编辑复合体结合

就在68公里外，克莱因斯弗博士的团队正从另一个角度看待这个问题：他们决定去掉模板中的RNA，使用一个完整的DNA模板。然而，问题是如何将其绑定到编辑复合体。“正如科学中经常发生的那样，解决方案在最意想不到的时候出现了”Joana Ferreira da Silva解释道。

关键时刻是当Connor (Tou，共同第一作者)读到明尼苏达大学Wendy Gordon slab的一篇论文时，这篇论文开创了HUH内切酶的许多工作。“当我们阅读他们的工作时，我们意识到这些内切酶可能提供了一种将DNA模板与编辑器共价连接的方法。这就是我们对推动这项技术向前发展感到非常兴奋的地方。”

HUH内切酶能够与特定的单链DNA序列共价结合。通过将猪圆环病毒2 (PCV2)的HUHe连接到nCas9上，kleinver的团队就能够将称为click DNA (clkDNA)的单链DNA模板绑定到它们的编辑器上。

这一创新使研究小组能够用来自大肠杆菌DNA聚合酶I的3'-5'外切酶缺陷Klenow片段替代在prime editors中发现的RT，从而产生第一代click editors(CE1)，从而在多个位点和细胞类型中实现了有效的基因编辑。他们还展示了他们的CE结构与广泛的dna依赖性聚合酶的兼容性，包括那些具有天然高保真度和加工能力的聚合酶。

虽然这两种系统已被证明在体外工作相似，但在体内递送方面可能存在显着差异。例如，融合的复合物太大而不容易递送，到目前为止，只有基于aav的内部系统被证明可以有效地递送这种复合物。另外，不受束缚的编辑器复合体可以作为两个独立的片段递送，但由于DNA聚合酶是独立地招募到编辑位点的，因此其浓度可能是效率的限制因素。研究小组正在探索的另一种方法是非病毒传递，在提供合成gRNA和DNA模板的同时，为mRNA上的DPE或CE编码提供了额外的灵活性。