【前沿资讯】CRISPR检测新动向——Cas12、Cas13引领体外诊断潮流

CRISPR检测是一种新型核酸检测技术，可以快速检测任何已知的核酸序列。与传统qPCR等现有分子诊断技术相比，CRISPR检测具有灵敏、特异、快速和低成本等明显优势，可广泛应用于POCT、临床感染检测、肿瘤筛查、伴随诊断、食品安全等多个领域。借助CRISPR技术，分子诊断的时间将从现在的几个小时缩短至10-20分钟。

一、CRISPR-Cas12b技术助力精准诊断支原体肺炎

原文链接：https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1147142

支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一种重要的病原体，可导致各年龄段人群尤其是极端年龄段的人群发病和死亡，由于其无症状和非特异性感染的特点，以及缺乏具有良好敏感性和特异性的最佳诊断试验，MP感染的流行率被大大低估，难以评估MP对公共卫生的真实影响。

为此，研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas12b的检测平台，该平台基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，用于快速、简单和准确地诊断MP感染，该平台被称为MP-RPA-CRISPR。MP-RPA-CRISPR能够检测低至5 fg的MP菌株基因组DNA模板，并能够准确区分MP菌株和非MP菌株，为了评估该检测方法的临床性能，文章使用96份疑似呼吸道感染患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本进行了测试。结果显示，该检测方法准确地诊断了45份MP感染样本和51份非MP感染样本，其结果与微流体芯片技术一致。CRISPR检测提供了一种快速、简单和准确的诊断MP感染的方法，对于及时治疗和防止疾病传播起到至关重要的作用。

图1 使用CRISPR-Cas12b进行高灵敏度的检测

二、CRISPR/Cas13a检测肿瘤衍生的外泌体miRNA

原文链接：https://doi.org/10.1002%2Fadvs.202301766

miRNA在肿瘤发展过程中起着重要的调控作用，而胞外囊泡（EV）中包含了丰富的miRNA信息，可以作为癌症诊断和治疗的潜在生物标志物。然而，现有的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在一定限制。为了解决这一问题，研究人员采用了CRISPR/Cas13a系统进行miRNA的检测。

为达到更好的检测效果，研究人员设计了三种不同的FQ探针，并测试了不同反应条件对检测结果的影响。结果发现最佳的探针序列为DNA-RNA-DNA连接子，最佳反应条件为等摩尔浓度的LwaCas13a和crRNA。通过优化探针序列和反应条件，研究人员成功实现了对肿瘤来源的胞外囊泡中miRNA的高灵敏度和特异性检测，CRISPR/Cas13a系统为癌症的诊断和治疗提供新的工具

图2 优化的CRISPR/Cas13a检测肿瘤来源的胞外囊泡中的miRNA

三、基于CRISPR-Cas13a建立准确检测OXA-48和GES型碳青霉烯酶的方法

原文链接：https://doi.org/10.1128%2Fspectrum.01329-23

碳青霉烯酶是一种能够水解碳青霉烯类抗生素的酶，是细菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的主要机制之一，OXA-48和GES型碳青霉烯酶是其中两种常见的类型。碳青霉烯酶耐药病原体的出现对公共卫生构成了严重威胁，这些病原体既难以治疗也难以在临床微生物学实验室中被检测出来。因此，研究人员正在努力开发高度特异、敏感、准确和快速的诊断技术，以防止这些微生物的传播。

研究人员利用CRISPR-Cas13a技术设计了一种能够准确检测OXA-48和GES型碳青霉烯酶的检测方法，利用Cas13a蛋白对目标基因序列的特异性切割，诱导细菌产生表型变化，通过检测这些表型变化，可以推断出目标基因序列。为了评估这一技术，研究者们使用LAMP-CRISPR-Cas13a检测方法，对68个OXA-48样品的肺炎克雷伯菌临床分离株、64个产GES-6和GES-14的肠杆菌科临床分离株、9个产GES-5的假单胞菌临床分离株、5个产GES-6的鼠伤寒沙门氏菌临床分离株以及3个产GES-6的假单胞菌临床分离株进行检测。使用CRISPR-Cas13a方法检测耗时不到2小时，对OXA-48和所有GES碳青霉烯酶均显示出100%的特异性和敏感性。表明CRISPR-Cas13a系统在开发快速、准确的诊断方法方面具有巨大的潜力。