【前沿资讯】基因编辑新动向--基因敲除细胞揭示铁死亡关键因素

CRISPR/Cas9基因敲除技术在生命科学、医学和药物研发等领域都有着广泛的应用前景，如利用基因敲除技术建立疾病模型、进行药物筛选和靶点验证、敲除致病基因实现对疾病的基因治疗等。本文选取三篇基因敲除细胞的相关研究为大家进行解读，带您了解这一前沿技术的最新进展。

一、FKRP基因敲除细胞疗法引领LGMDR9疾病治疗新方向

原文链接：https://doi.org/10.3390/cells12202444

Limb-Girdle Muscular Dystrophy R9（LGMDR9）是一种由Fukutin-related protein（FKRP）基因缺陷导致α-DG的糖基化缺乏，进而破坏了细胞膜的完整性引起的罕见的神经肌肉疾病，目前，使用重组腺相关病毒（rAAV）作为载体进行基因疗法成为治疗此类疾病的重要手段，为这类神经肌肉疾病提供有效的治疗策略。

在临床试验阶段，为了证明治疗产品的安全性和有效性，研究人员使用CRISPR-Cas9技术创建了FKRP基因敲除细胞，该细胞完全缺乏α-DG糖基化，同时开发了一种高通量的On-Cell-Western技术来评估基因疗法对敲除细胞中α-DG糖基化的恢复作用，从而量化FKRP转基因的生物活性，通过这种方法，可以确定半最大有效浓度（EC50），从而比较不同批次的rAAV-FKRP产品。通过FKRP基因敲除细胞模拟LGMDR9疾病的状态，从而更好地理解该疾病的发病机制和潜在的治疗方法，为研究LGMDR9疾病提供了有力的工具。

图1 FKRP基因敲除细胞α-DG蛋白质水平降低

二、解锁脓毒症之谜：METTL3基因敲除细胞揭示NETs与铁死亡的关键作用

原文链接：https://doi.org/10.1002%2Fctm2.1389

在脓毒症诱导的急性肺损伤（SI-ALI）中，中性粒细胞胞外陷阱（NETs）发挥了重要作用。NETs由多形核中性粒细胞释放，具有强大的抗菌功能，但在脓毒症等感染性疾病中，也参与了病情的加重。本文研究发现，NETs通过诱导铁死亡（ferroptosis）在肺泡上皮细胞中引发SI-ALI。在SI-ALI的患者和模型小鼠中，NETs的过度释放伴随着铁死亡的增强，这一过程依赖于METTL3介导的HIF-1α的m6A修饰以及随后的线粒体代谢重编程。

在体外实验中，研究人员通过RNA测序和MeRIP-seq技术对METTL3过表达和敲除细胞进行了比较，发现METTL3敲除后，NETs诱导的SI-ALI症状得到缓解，NETs引起的铁死亡被显著抑制，表明METTL3在NETs引起的肺损伤中起到关键作用，METTL3通过调控铁死亡来影响NETs的作用。该研究表明METTL3在NETs引起的SI-ALI和铁死亡中起到关键作用，METTL3基因敲除细胞帮助研究人员深入了解NETs在SI-ALI中的作用机制，并为未来的治疗提供了新的思路和方法。

图2 METTL3对SI-ALI和铁死亡调控具有重要作用

三、TNF-α基因敲除细胞成为研究PMN的新星

原文链接：https://doi.org/10.1172/jci170733

有效的免疫反应对于宿主防御至关重要，然而，免疫细胞的招募和失调会导致许多病理状况中的炎症反应。PMNs是专门处理感染挑战的效应细胞，但它们在组织中的积累和活动可能导致炎症加剧和组织损伤。PMN穿越内皮细胞需要一系列粘附步骤，而肠道黏膜中存在大量驻留巨噬细胞，它们具有独特的保护功能，可以释放抗菌肽和其他化学物质来抵抗病原体入侵，然而，肠道炎症可以破坏这种平衡，导致过度招募和激活PMNs，进一步加剧炎症反应。

为了解肠道巨噬细胞如何调节PMN招募和功能，研究人员从感染或炎症部位获取血管相关巨噬细胞（VAMs），利用基因编辑技术CRISPR-Cas9对VAMs中的特定基因TNF-α进行敲除，在基因敲除前后，观察PMN与VAMs的粘附、信号传递等过程。在敲除TNF-α基因后，VAMs释放的趋化因子减少，导致PMN的募集效率降低，相较于对照组，基因敲除组中的炎症反应明显减轻，组织损伤减少。TNF-α基因敲除细胞在本研究中揭示了TNF-α在调控PMN-EC相互作用和TEM过程中的作用，对血管相关巨噬细胞的深入研究及治疗过度炎症反应相关疾病提供新的治疗策略。