CRISPR文库筛选进阶指南！七大实验要点在这里！
CRISPR文库筛选是一项综合性高的实验，其流程不仅漫长，涉及多种实验与分析环节，而且成本也相对较高。每个步骤都藏有众多细节，稍有不慎，便可能掉进“坑”里。许多初涉此领域或准备开展文库筛选实验的科研人员，对于文库筛选的实验流程或多或少都存有疑惑。今天，小艾同学收集了一些科研er们经常提问的问题进行详细解答，旨在帮助大家设计更科学的实验方案，加速您的实验进程。
一、可以直接用已经转入sgRNA文库的 cell pool进行筛选实验吗？
答：不可以。为了节省科研时间，不少科研人员都倾向于购买现成的文库筛选相关产品直接开展实验，比如，选择购买已完成扩增和质控的文库质粒/病毒，或已转入sgRNA文库的cell pool。如果您购买的文库质粒/病毒质量有所保证的话（覆盖度/均一度达标），这确实是加速您实验进程的好办法，但是，我们不建议采用已转入sgRNA文库的cell pool直接进行筛选实验。
细胞最终交付形式为冻存，因此细胞需要经过复苏后才能进行实验。由于不同基因在细胞中的功能及其调控机制的差异，基因敲除可能对细胞的生存能力造成不同程度的影响。复苏过程中，不同基因编辑事件的细胞在生存能力、增殖能力上存在区别，可能导致部分sgRNA丢失，从而显著降低文库的覆盖度和均一性，这种文库的质量是难以保证的。使用这样的cell pool做后续的功能筛选等研究也就没有科学意义。
二、原代细胞可以做CRISPR文库筛选吗？
答：最好不要使用原代细胞。在选择用于CRISPR文库筛选的细胞系时，需遵循以下原则：1）与研究目的相符2）确保属源无误3）可以稳定传代4）转染效率高。常见的有肿瘤细胞系、永生化细胞系和干细胞/ipsc细胞等。
原代细胞，是从机体取出后立即培养的细胞，能够更加准确模拟体内环境的真实情况，因此不少科研人员更青睐用原代细胞进行文库筛选实验。然而，大多数原代细胞均处于终末分化的阶段，其传代和增殖能力较弱。在构建细胞筛选文库的过程中，经常出现因难以传代增殖，导致无法获得cell pool做后续的压力筛选；或者部分sgRNA丢失使文库覆盖度和均一性降低。因此，通常不推荐使用原代细胞进行文库筛选实验。当然，如果真的必须使用的话，只能选择sgRNA数目较少的文库，同时适当降低细胞覆盖度，在获得cell pool后尽快进行压力筛选。
三、Cas9稳转株构建常见问题
1）必须使用单克隆Cas9稳转株吗？
理论上是需要用单克隆，这样能保证Cas9稳转株的编辑效率稳定、均一。但是从我们的经验和相关的文献报道来看，使用多克隆的Cas9稳转株做文库筛选对筛选结果的准确性没有很大的影响。
2）如何提高Cas9稳转株的编辑效率？
在一定范围内，可以通过Cas9表达来提高编辑效率。因此，我们在用Cas9慢病毒转染细胞时候，在不影响细胞的活性，可以尽可能提高转染的MOI，增加Cas9的拷贝数，提高Cas9的表达水平。
3）如何检测Cas9稳转株的编辑效率？
通常情况下，要检测Cas9稳转株的编辑效率，第一反应是检测Cas9的表达水平，但这只是一个侧面验证的指标。为了更全面地评估编辑效果，我们建议使用经过验证的高编辑效率的sgRNA，将这些sgRNA递送至Cas9稳转株中，通过测序验证编辑效率。
四、文库质粒扩增多少量，才能满足后续的实验呢？
在计算质粒文库的用量时，用量必须满足后续的压力筛选实验。需要考量多个指标，包括sgRNA文库的大小、细胞MOI、细胞覆盖度、压力筛选的分组数等。同时还需要考虑每个实验环节的损耗，比如文库质粒扩增后质粒大提的损耗、病毒包装和细胞转染的效率等。因此，需要在质粒扩增时应当多扩增一些以备不时之需。
根据我们的实验经验，确定质粒文库用量时，我们需要计算质粒扩增的转化效率。通过计数稀释一定倍数后的克隆数，倒推出克隆总数。克隆总数需要达到500×~1000×的sgRNA数目，才能满足实验要求。如果克隆数不足，需根据目前的克隆数增加电转数量，以达到足够的覆盖度。
五、文库质粒怎么转化扩增？电转法还是化学法？可以用核转仪做吗？
文库质粒转化扩增的方法通常使用电穿孔法或化学转化等方法，不建议使用核转仪进行扩增。电穿孔法是目前最高效的质粒转化方法，将质粒DNA与电穿孔细胞混合，并施加电脉冲以促进质粒进入细胞内。电穿孔后，将细胞播种在选择性培养基上，以分离目的质粒的菌落。电穿孔法的关键是使用高效的感受态细胞。此外，不建议使用化学转化的方法来转化较大的质粒文库，这样会因为转化效率不高，而导致sgRNA文库扩增后均一性和覆盖度降低。如果是转化较小的质粒文库，化学转化方法也能尝试使用。
六、文库病毒转染细胞的注意事项
1）确认文库病毒滴度是如何测定的。现今病毒滴度的测定通常使用qPCR来检测，但这种测定方法并不能真实反映活性病毒的真实滴度。因为qPCR检测是基因组片段数量，那么死病毒和活病毒都能被检出，最终结果为活病毒和死病毒的总滴度。根据我们的实验经验，通过qPCR来检测，活病毒真实滴度大约仅为检出滴度的十分之一，因此，我们推荐直接滴定细胞。
2）通过滴定细胞的预实验，确认转染时的真实实验体系。实验操作中，取少量文库病毒，稀释成多个浓度梯度，然后每个浓度梯度转染相同的目的细胞系，并且纪录所有的实验条件，包括病毒剂量、细胞数目、药筛浓度、培养条件等，最后选择转染效率大约为30%的梯度组别。在进行实际转染操作时，将这些转染条件等比例放大即可。
七、文库测序建库的注意事项？为什么序列扩增不出来？
注意要点：
1）gRNA提取：这个环节需要注意每个分组的细胞数，细胞数应为文库sgRNA的种类的400-1000×，每种sgRNA 的细胞群体包含约 400–1000 个细胞，确保测序的质量。另一个需要注意的是，DNA 纯化柱不能超载，否则会降低样品中 sgRNA 的多样性。
2）gDNA PCR：可以进行两轮PCR扩增（巢式PCR），提高靶片段扩增的特异性。此外，用尽可能低的循环数进行扩增。
如果序列扩增不出来，可能需要重新评估PCR 反应条件，例如引物浓度、PCR 循环参数和反应体系等。此外，如果使用的是 Illumina 测序平台，可能需要使用适当的引物和测序方法，以确保正确地测序 sgRNA 序列。如果仍然无法获得所需的序列，需要检查文库构建方法和质量，以确保 sgRNA 序列已正确地插入到文库中。
每个实验环节，都有很多要注意的细节，而这些细节往往能影响我们整个文库筛选的成败。今天借用这小小篇幅，与大家一同学习讨论，希望这次分享有助于大家的实验。
CRISPR文库筛选直播课指路：
CRISPR文库筛选第一课：CRISPR文库筛选实验流程及应用
CRISPR文库筛选第二课：CRISPR激活文库实验流程及应用
CRISPR文库筛选第三课：CRISPR文库筛选x单细胞测序
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