【文献解读】利用工程化crRNA提高LbuCas13a检测灵敏度
CRISPR系统是细菌和古细菌适应性免疫的一部分，由crRNA引导的Cas核酸酶可以被编辑以识别所需的目的序列，从而进一步的进行基因编辑或核酸检测。目前有多种提高CRISPR系统检测能力的方法，比如：将RNA结合域融合到Cas13a活性位点、设计发夹报告器、整合单个核酸不同核苷酸区域的多个crRNA，以及crRNA工程化改造等。crRNA工程化是最简单经济的方法，已被用于提高Cas9和Cas12a核酸酶的顺式切割活性，从而提高基因编辑的效率和特异性，但迄今为止还没有报道使用工程化crRNA来增强Cas13a系统的核酸检测能力。
今年三月，清华大学ESPC国家重点联合实验室和北京市疾病预防控制中心的研究人员在Biosensors and Bioelectronics上发表题为Improving trans-cleavage activity of CRISPR-Cas13a using engineered crRNA with a uridinylate-rich 5′-overhang的研究论文，研究人员通过各种扩展和化学修饰来设计Cas13a的crRNA，确定了性能最佳的工程crRNA和优化条件，并采用改良的LbuCas13a系统结合等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术检测临床样品中SARS-CoV-2的RNA，为后续开发更多工程化Cas13a/crRNA系统提供了有价值的参考。
一、探索不同长度U延伸及化学修饰对crRNA性能的影响
研究人员选择了一个常用的crRNA进行工程化，通过在crRNA的3′或5′端增加不同的尿嘧啶（U）数量或通过化学修饰来提高Cas13a的转切割活性。实验结果显示，5′端3U延长的crRNA显著增强了LbuCas13a的反式切割活性，而3′端3U的延长则降低了活性；用PS-2′-OMe分别对两端延长3U的crRNA进行化学修饰，Cas13a的稳定性有所提高，但反式切割活性降低；使用cEt取代crRNA的重复区或引导区胞嘧啶的2 ′-OH，并测试其反式切割活性，发现重复区有cEt取代的crRNA其Cas13a活性极小，A3和G4引导区有cEt取代的crRNA比原始crRNA更活跃；研究人员还探索了不同间隔长度的crRNA对Cas13a的影响，其中24 nt的crRNA显示出比20 nt crRNA更高的活性。
图1 crRNA修饰影响Cas13a反式切割活性
二、优化crRNA和LbuCas13a的结合机制
为研究crRNA和Cas13a的结合机制，研究人员进行了全原子分子动力学模拟（MD），用20 nt 5′3U、24 nt、24 nt 5′7U和28 nt crRNA模拟LbuCas13a蛋白在缺少/存在靶标的情况下的反式切割活性。实验采用均方根偏差(RMSD)来测量MD模拟系统的构象变化，发现5′端突出部分与Cas13a的Helical-1和HEPN2结构域之间的相互作用对复合物的稳定性起到了关键作用，模拟结果揭示了crRNA修饰对Cas13a结合和转切割活性的影响，说明了为何5′端延长的crRNA能够提高系统的活性。此外，研究人员对20 nt和24 nt 5′ 7U crRNAs进行了Michaelis-Menten动力学研究，当LbuCas13a-crRNA与靶RNA激活剂分子结合时，催化20 nt和24 nt 5′7U crRNA的反式裂解速率分别为6.0和12.4转/秒，计算得到的24 nt 5′7U crRNA对LbuCas13a的催化效率比20 nt crRNA高3.6倍，表明24nt 5′7U的crRNA可能有助于将Cas13a复合物稳定在RNA反式切割的最佳构象中。
图2 U富集的5′端延长提高Cas13a-CRISPR复合物结合亲和力的机制
三、确定LbuCas13a反式切割的离子依赖性
为了确定Cas13a反式切割的离子依赖性，研究人员在侧支切割实验中测试了各种二价离子，发现Mg2+、Ca2+和Mn2+存在的情况下LbuCas13a的反式切割活性增强，而Co2+、Zn2+和Cu2+显著抑制LbuCas13a活性。为了研究抑制作用的剂量依赖性，研究人员测定了Co2+和Mg2+浓度对LbuCas13a反式切割活性的影响，结果表明增加Co2+浓度可显著降低20 nt和24 nt 5′7U crRNAs的荧光信号，且在所有浓度下，24 nt 5′7U crRNA的活性都高于20 nt crRNA；LbuCas13a活性随Mg2+浓度的增加先升高后降低。通过改变Mg2+的量，确定最佳的Mg2+浓度为1.5 mM。肝素用于避免LbuCas13a-crRNA二元复合物与ssRNA之间的非特异性相互作用，研究人员比较了CRISPR-Cas13a系统在有肝素和没有肝素的核酸酶测定缓冲液中的反式切割活性，以验证肝素诱导的crRNA与LbuCas13a-crRNA二元复合物之间非特异性相互作用的抑制是否会增加LbuCas13a-crRNA复合物的数量，从而增强反式切割活性，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，肝素存在时crRNA残留较多，说明肝素可以阻止crRNA与ssRNA结合域相互作用。
图3 U富集的5′端延长提高CRISPR-Cas13a辅助核酸检测的灵敏度
四、测试优化crRNA与CRISPR-Cas13a的适用性
研究人员使用上述相同的工程策略对SARS-CoV-2的N和Orf1ab基因5′端具有7U延伸的crRNA进行了修饰，两种工程系统对N和Orf1ab基因的敏感性分别比未修饰的系统提高了6.88倍和3.44倍，更换LwaCas13a进行相同的实验，得到相似的结果，表明5′端延伸也有利于LwaCas13a系统的侧支切割。为进一步测试增强型CRISPR-LbuCas13a系统识别靶RNA内点突变的特异性，研究人员生成了两个靶标，每个靶标在种子区(S15)或间隔区(S5)上都有一个单点突变，与20 nt crRNA相比，24 nt 5′7U crRNA在两种情况下的单核苷酸错配耐受性都更高，并且产生更强的荧光信号。
图4 CRISPR-Cas13a系统与5′7U crRNA的适用性
五、使用工程化crRNA结合LbuCas13a系统对SARS-CoV-2临床样品进行检测
研究人员建立了RT-RPA扩增的5′7U crRNA CRISPR-LbuCas13a系统对SARS-CoV-2的S基因进行检测。通过42°C30分钟的RT-RPA反应和10分钟的CRISPR-Cas13a裂解反应对45份临床样本RNA提取物中的S基因进行快速检测，包括1份经RT-qPCR验证的野生型SARS-CoV-2阳性样本，35份经RT-qPCR和基因组测序验证的Omicron阳性变异样本，以及9份经RT-qPCR验证的阴性样本，阳性对照和阴性对照分别用合成RNA和无核酸酶水进行检测。尽管RNA已经储存了两年多，但研究人员还是成功地鉴定出了野生型SARS-CoV-2，在Ct值< 34的情况下，该技术在40分钟内准确识别出患者样本中Omicron变异的S基因，一致性为20/21，表明该技术在COVID-19诊断方面具有广阔的潜力。
图5 CRISPR-LbuCas13a系统结合RT-RPA扩增检测SARS-CoV-2
综上所述，研究人员通过工程化crRNA，CRISPR-Cas13a系统的灵敏度得到了显著提高，使其更适用于低病毒载量的样本检测，结合RT-RPA技术在较短的时间内完成对SARS-CoV-2的检测，不仅提高了CRISPR-Cas13a系统的性能，还为未来对其他CRISPR系统的工程化提供了宝贵的经验和方法，使CRISPR-Cas13a系统有望成为POCT诊断的有力工具。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116239
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