CRISPR检测保姆级攻略，实验前必看！

CRISPR检测原理
CRISPR检测技术是基于CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）技术的原理而发展出的一种检测手段。是由靶标核酸激活Cas蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成靶标核酸检测的过程。该技术利用CRISPR-Cas系统的特异性识别与特有的附属切割能力，实现对目标DNA或RNA序列的高效、快速、灵敏检测。CRISPR检测具有多项显著优势，包括高灵敏度、高特异性、快速编辑、经济实用等，因此在环境检测、动物疫病、疾病监测、宠物疾病、食品安全等多个领域得到了广泛应用。

小艾同学整理了CRISPR检测的干货知识点，希望能帮助到你。

一、Cas酶的选择
Cas酶在CRISPR检测中扮演着至关重要的角色，能够精准地识别并切割与目标序列互补的DNA或RNA，从而实现对特定基因的高效检测。由于实验目的、靶标基因、操作条件等差异，选择合适Cas酶也尤为重要。
Cas12a：又称Cpf1，它是一种核酸内切酶，能特异性识别并剪切带PAM（5'-TTTN-3'或5'-TTN-3'）的双链DNA（dsDNA）靶标，使DNA双链断裂并生成黏性末端。此外，对单链DNA（ssDNA）靶标的识别和剪切不依赖PAM序列。
Cas12b：同样是一种依赖sgRNA介导的核酸内切酶，能特异性识别并剪切带PAM（5'-TTN-3）的dsDNA，使DNA双链断裂并生成黏性末端。特别的是，它在45-65℃的中高温环境中具备更高的切割活性。
Cas13a：它在sgRNA引导下，可以识别并切割体系中的特异单链RNA。在切割特定RNA序列后，其“附属切割”活性会被激活，可高效地切割体系中的任意序列ssRNA。

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二、crRNA设计与合成：
crRNA是CRISPR-Cas系统中的一个关键组成部分，它识别并引导Cas蛋白到目标核酸序列位置，通过与目标DNA或RNA序列的互补配对，指导Cas蛋白进行精确的切割或编辑。crRNA极大影响检测体系的灵敏度，因此在实验中我们需选择效果最优的crRNA，crRNA设计合成涉及以下注意事项：
1.目标序列选择:选择一个特定的目标序列作为设计的起点，通常是根据目标基因的功能和相关研究的需要来确定，选择基因组中的高拷贝重复片段作为靶标基因。
2.PAM序列选择:在目标序列附近选择适当的PAM序列。

3.避免剪切位点:避免剪切位点与其他非目标基因席列相匹配。这可以通过使用序列比对软件来实现。
4.避免剪切位点的二级结构:避免目标序列和其他非目标序列形成稳定的二级结构
5.序列选择与验证:在设计过程中，可以使用序列比对工具和结构预测工具来评估设计的crRNA的特异性和有效性，最后通过实验证实设计的crRNA的特异性和剪切效果。
以下是我们常用的crRNA引物设计序列：
1. LbCas12a：
5'AAUUUCUACUAAGUGUAGAUNNNNNNNN 3'(N表示与特导靶标序列互补配对的spacer区)
2.AapCas12b：5'-GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUU

GAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNN-3'，(N表示与特导靶标序列互补配对的spacer区)

3.LwaCas13a：5'GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'，(N表示与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-28nt)
4.LbuCas13a：5'GGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACCAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'，(N表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)

三、恒温扩增体系选择
恒温扩增技术（Isothermal Amplification）是实现快速、精确检测的关键方法之一。它相比传统的PCR方法更加简便和快速，特别是在需要现场快速检测或设备条件有限的情况下显示出了其独特的优势。下面为大家介绍一下常见的恒温扩增体系。
1. LAMP（环介导等温扩增）
特点: LAMP技术依赖于一组特制的引物和Bst DNA聚合酶的特异性裂解活性，能在一个恒定的温度（通常是60°C-65°C）下进行。这个方法能在短时间内（一般小于一个小时）高效地进行扩增，并且可以通过肉眼观察扩增结果（如加入荧光剂）。
2. RPA（重组酶聚合酶扩增）
特点: RPA技术在室温或接近室温条件（37°C-42°C）下工作，无需特殊设备。RPA通过使用重组酶来解开双链DNA，在较短时间内完成目标DNA的扩增。
3.NASBA（核酸序列依赖的扩增）
特点：NASBA反应在恒温条件（41°C-42°C）下进行，扩增的产物可以是单链DNA或双链RNA。可以检测到较低浓度的RNA靶标，但对试剂的稳定性要求较高，且操作相对复杂。

在选择恒温扩增体系时，需要综合考虑多种因素，包括：实验目的、目标序列特性、实验条件、以及扩增体系的稳定性和效率等。以下是在选择恒温扩增体系时考虑的两大重要因素：
1）目标序列特性：目标序列的长度、GC含量、是否存在二级结构等因素都会影响到恒温扩增的效果。因此在选择恒温扩增体系时，需要充分了解目标序列的特性，并选择适合该特性的扩增体系。
2）扩增体系的稳定性和效率：恒温扩增体系的稳定性和效率是选择时需要考虑的重要因素。稳定的体系可以减少实验误差，提高结果的准确性；高效的体系可以缩短实验时间，提高实验效率。

CRISPR检测作为“下一代分子诊断技术”，同学们在开展实验前，选择合适的Cas酶、最佳的crRNA序列以及恒温扩增体系，对于后续实验的特异性与灵敏度影响重大。