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【本月之星】泛素化相关文库、脂质代谢文库和小鼠全基因组敲除文库

CRISPR文库筛选是一种基于CRISPR/Cas9技术的高通量基因筛选方案，通过构建包含成千上万个sgRNA的文库，并将这些sgRNA克隆到慢病毒载体中，以低MOI感染靶细胞。这种方法可以确保每个细胞只被一种sgRNA感染，从而实现针对不同sgRNA对应基因的功能筛选。小编为大家推荐本月最畅销的三款文库现货，并附上该文库相关研究文献解读，希望能为大家的科研道路添砖加瓦。


一、CRISPR-Cas9 敲除文库筛选探索LC3B泛素化调控关键基因

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100405

自噬是一种细胞降解途径，对于维持细胞稳态至关重要，其缺陷与多种疾病的发病机制相关，包括神经退行性疾病、心肌病变、癌症、2型糖尿病和免疫系统疾病。LC3B通过泛素激活酶和泛素连接酶催化发生泛素化，这一过程导致LC3B通过蛋白酶体途径降解，从而在应激条件下降低LC3B水平和自噬活性。然而，能够对抗这一过程的机制尚不清楚。

研究人员使用CRISPR泛素化敲除文库，针对661个与泛素化相关的基因进行了筛选，以此鉴定能够调节自噬蛋白LC3B水平的基因。结果表明，去泛素化酶USP10（Ubiquitin Specific Peptidase 10）基因的敲除降低了细胞内LC3B-I和LC3B-II两种形式的蛋白水平，导致LC3B通过蛋白酶体途径的降解增加，USP10能够去泛素化LC3B，从而增加LC3B的水平和自噬活性。通过CRISPR泛素化敲除文库筛选和鉴定USP10这一新的LC3B调节因子，揭示了USP10在调控自噬过程中的重要作用，增进了我们对自噬调控机制的理解，并为未来的研究和药物开发提供了新的视角。

图1  CRISPR-Cas9 KO筛选调控LC3B水平的泛素化相关蛋白

二、CRISPR-Cas9文库筛选确定了PLIN2和脂滴调节的机制

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.07.001

PLIN2是一种在脂滴上丰富的蛋白质，在脂滴的生物生成、分解以及与其他细胞器的相互作用中起着重要作用。PLIN2与多种疾病有关，包括肝脂肪变性、炎症条件和多种癌症。此外，PLIN2与脂滴之间存在相互关系，脂滴稳定PLIN2，而PLIN2也稳定脂滴。尽管PLIN2在脂滴代谢中的作用已被认识，但调控PLIN2水平的机制尚不完全清楚。研究者们希望通过CRISPR-Cas9筛选方法，识别影响PLIN2表达和翻译后稳定性的遗传修饰因子。

研究人员使用了定制的筛选文库：Human Lipid Droplet and Metabolism sgRNA Library，针对与脂滴和代谢相关的基因进行筛选，鉴定了影响PLIN2表达和翻译后稳定性的遗传修饰因子，发现E3泛素连接酶MARCH6是调节三酰甘油（TAG）生物合成和脂滴的因子，通过影响PLIN2的稳定性来发挥作用。通过人脂质代谢文库筛选发现的新基因和调控机制可能成为治疗与脂质代谢紊乱相关的疾病的潜在靶点，并通过识别调控PLIN2和脂滴的基因，增进了对脂滴如何在细胞内形成、分解和与其他细胞器相互作用的理解。

图2  CRISPR-Cas9筛选PLIN2-GFP的细胞类型和代谢状态依赖性调节因子

三、小鼠全基因组敲除文库筛选揭示PPP6C是TNF诱导坏死性凋亡的正向调节因子

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41419-022-05076-1

坏死性凋亡是一种由特定信号通路介导的程序性细胞死亡形式，通常由肿瘤坏死因子（TNF）等刺激因子触发，并通过受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）-RIPK3-混合谱系激酶域类似蛋白（MLKL）信号通路介导。RIPK1、RIPK3和MLKL作为坏死性凋亡的关键效应分子，它们在调节坏死性凋亡中的作用已经被广泛研究。然而，磷酸酶是否参与坏死性凋亡的调节仍然不清楚。

研究人员使用小鼠GeCKOv2 CRISPR敲除文库（mouse GeCKOv2 CRISPR knockout pooled library）进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选，以鉴定调节肿瘤坏死因子（TNF）诱导的坏死性凋亡（necroptosis）的基因。PPP6C（蛋白磷酸酶6的催化亚基）被鉴定为TNF诱导的坏死性凋亡的正向调节因子，PPP6C的缺失可以保护细胞免受TNF诱导的坏死性凋亡，并且这种保护作用是依赖于其磷酸酶活性的，PPP6C的缺失导致TAK1的超活化和RIPK1激酶活性的降低，在小鼠胃肠道中，PPP6C的杂合子缺失可以减轻坏死性凋亡相关的组织损伤和炎症。小鼠GeCKOv2 CRISPR敲除文库阐明了PPP6C通过TAK1-IKK信号轴调控RIPK1激酶活性的分子机制，为开发针对PPP6C或其调控途径的小分子药物提供了理论基础。

图3  PPP6C的缺失可以防止TNF诱导的坏死性凋亡


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