【前沿资讯】Prime Editing新动向-提高Prime Editing编辑效率的三种方式

Prime editing是一种基于CRISPR/Cas系统改进的基因编辑技术，可以在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换，具有更高的精确性和更低的误差率。

Prime editing一经问世，便引起许多科研工作者的广泛关注，被广泛用于遗传性疾病、基因突变型疾病和癌症治疗上的研究，如通过编辑患者的细胞基因组纠正致病的突变基因，从而治疗遗传性疾病，或通过编辑癌细胞基因组中的致癌基因，阻止其生长和扩散。本文选取了三篇Prime editing相关研究的文章进行解读，为大家带来最新的Prime Editing研究动向。

一、截断的逆转录酶通过分裂AAV载体增强Prime editing

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.07.001

Prime editing是一种新型的基于CRISPR的基因组编辑技术，它不需要双链DNA断裂或外源性供体模板DNA，展现出在生物医学研究和基因治疗方面的巨大潜力。尽管Prime editing技术具有多功能性和精确性，但它在不同类型的编辑、目标位点和细胞类型中的效率存在很大差异。因此，为了实现更广泛的应用，需要提高Prime editing的效率。

研究人员筛选了11种不同来源的RT变体，使用GenScript算法优化其人类密码子，发现PE蛋白表达水平提高了1.4倍；通过删除RNase H结构域和进一步缩短RT序列，创建多个截短的PECO变体，使Prime editor在保持编辑效率的同时长度减少了621bp；为了实现有效的双AAV传递PE，研究人员构建了基于不同Cas9分裂位点和intein的分裂PE系统，确定了Rma 573-574和674-675分裂位点，这两个位点与Rma intein结合使用时，显著提高AAV载体的滴度和Prime editor效率。通过工程化改造和优化，研究人员成功提高了Prime editing技术的编辑效率，并且解决了AAV载体大小限制的问题，为未来的基因治疗和生物医学研究提供了一个更加有效和实用的工具。

图1 优化Prime editor长度并保持其编辑效率

二、Prime editor结构基础研究揭示引导pegRNA逆转录的分子机制

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07497-8

关于Prime editor如何识别pegRNA并与目标DNA相互作用的分子机制尚不清楚，限制了对Prime editing过程的理解和进一步的优化。为解决这个问题，研究人员在多种状态下测定了Prime editor的冷冻电镜(cryo-EM)结构，为理解这一创新的基因组工程系统提供了结构框架。

研究人员使用冷冻电镜技术（cryo-EM）对Prime editor复合体在不同状态下的结构进行了分析，包括预启动、启动、延伸和终止状态，成功获得了Prime editor复合体在多个状态下的高分辨率结构，揭示了其在引导逆转录过程中的动态变化；基于结构信息，研究人员设计了pegRNA变体和Prime editor变体，并对M-MLV RT进行截短和融合，成功开发了一种更小尺寸的Prime editor变体（PECO-Mini），它在保持编辑效率的同时，提高了AAV载体的滴度和Prime editing效率，活性测试结果显示工程化后的Prime editor变体在体外具有与原始Prime editor相当的活性。该研究揭示了Prime editor复合体在不同工作状态下的结构特征，为理解其分子机制提供了重要信息。

图2 Prime editor低温电镜结构

三、La蛋白促进不同类型Prime editor在不同的内源基因位点和细胞类型中的编辑效率

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07259-6

许多研究注重于提高Prime editor的系统性能从而提高其编辑效率，但对于Prime editing如何在细胞环境中工作以及其与细胞环境的相互作用如何影响编辑结果的了解仍然有限，研究人员尝试通过确定影响Prime editor的其它细胞决定因素来提高其编辑效率，并展开相关研究。

通过基因组规模的CRISPR干扰(CRISPRi)筛选，研究者们发现了一个关键的Prime editing促进因子——小RNA结合的外切核酸酶保护因子La。研究表明La蛋白通过其N端结构域与pegRNAs的3' polyU序列结合，从而促进Prime editing。La蛋白的这种作用对于不同类型的编辑（替换、插入、删除）和不同的细胞类型都是有效的。基于该发现，研究人员开发了一种新的Prime editor蛋白（PE7），该蛋白将La的RNA结合N端结构域融合到PEmax编辑器上。PE7编辑器在使用表达的pegRNAs和工程化pegRNAs（epegRNAs）以及为La结合优化的合成pegRNAs时，都能显著提高Prime editing的效率。