【前沿资讯】基因编辑新动向——fut8、atm和brca1基因敲除细胞提供癌症治疗新视角

基因敲除细胞是指利用CRISPR技术进行基因编辑，通过设计特定的sgRNA靶向目标基因的剪切位点，使Cas9蛋白与sgRNA结合并将目的基因从细胞中“剪切”掉，从而实现基因敲除的细胞。基因敲除细胞在生命科学、医学和药物研发等领域都有着广泛的应用前景，如利用基因敲除技术建立疾病模型、进行药物筛选和靶点验证、敲除致病基因实现对疾病的基因治疗等。本文选取三篇基因敲除细胞的相关研究为大家进行解读，带您了解这一前沿技术的最新进展。

一、FUT8-KO细胞发掘胰腺癌治疗新靶点
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2021.129870
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adencarcinoma, PDAC)是一种极其恶性的肿瘤，占所有胰腺癌的90%。研究表明，癌细胞表面的异常糖基化变化与肿瘤进展和转移正相关，α1,6-岩藻糖基转移酶（FUT8）是负责催化核心岩藻糖基化的关键酶，其在多种恶性肿瘤中的表达和激活异常，与多种生理和病理过程相关，尽管FUT8在其他类型的癌症中的作用已被观察到，但其在PDAC恶性转化中的具体分子机制和作为潜在治疗靶点的可能性尚不清楚。
研究人员使用CRISPR/Cas9系统在MIA PaCa-2和PANC-1细胞中敲除FUT8基因，通过Transwell迁移实验和创伤愈合实验评估FUT8-KO细胞的迁移能力，通过MTT实验和集落形成实验评估FUT8-KO细胞的增殖能力，并检测了FUT8-KO细胞中癌症干细胞标志物的表达水平。结果显示，与野生型细胞相比，FUT8-KO细胞的迁移能力、增殖和集落形成能力显著降低，FUT8-KO细胞中癌症干细胞标志物的表达降低。FUT8基因敲除细胞揭示了FUT8在胰腺癌中的重要作用，证明了FUT8可能是胰腺癌治疗的一个潜在靶点，为未来的胰腺癌治疗策略提供了新的视角。

图1 FUT8-KO细胞的建立

二、ATM基因敲除细胞诱导FANCD2蛋白酶体降解
原文链接：https://doi.org/10.1186/s12885-023-10772-y
神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一种常见的儿童实体瘤，临床表现和预后具有高度的异质性，尽管采用了多种治疗策略，但高风险NB患者的肿瘤对标准治疗存在抵抗性，并可能发展成转移。ATM基因与DNA损伤反应有关，位于11q的ATM基因的杂合性缺失和ATM基因的半合性突变在NB肿瘤中是互斥的。在NB细胞系中，ATM的敲低已被证明可以在体外和体内促进肿瘤形成，但ATM与肿瘤形成和癌症侵袭性之间的关联尚不清楚。
研究人员使用CRISPR/Cas9技术敲除了NGP和CHP-134 NB细胞系中的ATM基因，分析ATM基因敲除细胞的增殖和集落形成能力，Western blot检测与DNA修复途径相关的不同蛋白的表达，并在ATM基因敲除细胞中稳定转染FANCD2表达质粒以过表达FANCD2，免疫荧光显微确定蛋白表达情况。结果显示，ATM的缺失导致FANCD2蛋白水平下降，完全ATM基因敲除细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼表现出更高的敏感性，在ATM基因敲除细胞中重新引入FANCD2表达，可以恢复细胞的增殖能力。ATM基因敲除细胞揭示了ATM基因杂合性在神经母细胞瘤中的作用机制，并阐明了ATM失活如何增强NB细胞对奥拉帕尼治疗的敏感性，对治疗显示ATM基因剂量和侵袭性癌症进展的高风险NB患者具有重要意义。

图2 ATM基因缺失损害FANCD2的表达

三、BRCA1基因调控Swan71滋养细胞HMGA2水平
原文链接：https://doi.org/10.1002/mrd.23255
在早期胎盘发育中，肿瘤抑制基因和癌基因共同工作，以一种受控的方式调节细胞增殖和分化。BRCA1是一个已知的肿瘤抑制基因，它与ZNF350和CtIP形成复合体，结合到HMGA2基因的启动子区域，阻止其转录。这种调控在癌症细胞中已有研究，但在胎盘细胞中的研究较少。
研究人员使用CRISPR-Cas9系统在Swan71细胞系中敲除BRCA1基因，生成了BRCA1基因敲除（BRCA1 KO）细胞，通过感染Swan71细胞与含有miR-182过表达构建的慢病毒颗粒，使miR-182在细胞中过表达。结果显示，与野生型细胞相比，BRCA1 KO细胞显示出显著增加的HMGA2 mRNA和蛋白水平；miR-182的过表达导致BRCA1蛋白水平下降，HMGA2蛋白水平上升。BRCA1基因敲除细胞表明BRCA1在调节滋养层细胞中的HMGA2水平方面发挥重要作用，并且可能通过影响细胞凋亡参与胎盘的发育和功能，为理解BRCA1在胎盘发育中的作用提供了新的视角。