【文献解读】基于CRISPR-Cas系统的生物传感器多路检测策略

       近年来，CRISPR-Cas系统凭借其强大的特异性、高灵敏度和优异酶切割活性被广泛应用于核酸检测领域上。为了在有限的时间和成本内获取更多的有效信息，许多研究员致力于研究在单个CRISPR-Cas反应中实现多路核酸检测，特别是在COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2发生了各种突变，迫切需要开发CRISPR-Cas多重检测以支撑POCT检测。最近，郑州大学玉崧成副教授团队在ACS Synthetic Biology杂志上发表名为“Multiplexed Detection Strategies for Biosensors Based on the CRISPR-Cas System”的综述性文章。该综述总结了目前已有的基于CRISPR-Cas系统的多路检测策略的原理和特点，分析这些策略可能存在的挑战并进行展望。

       CRISPR-Cas生物传感器具有反应时间短和信号放大的特点，但是它的非特异切割活性使得其在一锅反应中难以区分多个靶点。尽管如此，已经有许多研究人员通过各种策略实现了基于CRISPR-Cas的多路靶标检测。根据使用方法不同，这些多路检测策略包括微流控技术、正交CRISPR-Cas系统、横向流动技术、信号逻辑门和其他技术等几方面。

一、CRISPR-Cas系统与微流控技术的结合
        这类策略利用微流控技术精确控制和操作微孔阵列中的小流体体积解决了靶标之间的信号干扰，使部署CRISPRCas系统用于多路检测成为可能。有研究人员提出了基于CRISPR-Cas13系统的CARMEN检测法来实现多重靶标检测。该方法通过制备带有物理隔离微孔的阵列芯片来运行。Welch等人基于CARMEN检测法开发了mCARMEN，通过集成商业流体微流体和仪器，以更短的检测时间和更简单的操作程序实现了多路检测。该芯片重量轻，但缺点在于只能一次性使用，增加了检测的相对成本，而且需要定制显微镜、芯片，临床应用操作复杂。
       同样利用微流控芯片技术，有人设计了可检测四种靶标的 CRISPR-RDB（基于 CRISPR 的反向点印迹）手持式微流控芯片，以肉眼可检测到的彩色信号输出完成对不同靶标的检测。该方法不仅实现了多重检测，并且具有高灵敏度、高特异性、操作方便、成本低以及无需大型仪器的优点，为现场检测提供了机会。但是，其所用的膜标记探针不能长期保存，并且单次检测靶标数量有限。Xing等人，提出了一种RAA技术与CRISPR-Cas12a集成的多重检测方法，并设计了一种易于操作、长期存储的手指驱动微流控生物传感器（FA-MB）。RAA和CRISPR-Cas12a步骤相互独立，并且所需的试剂可以冷冻干燥并嵌入芯片中进行长期存储，这在便携性上实现突破。

图1 CRISPR-Cas系统与微流控技术相结合的多路靶标检测策略

二、正交CRISPR-Cas系统
       利用不同Cas蛋白的不同底物偏好，不同Cas酶的正交性是基于CRISPR-Cas系统实现多路检测的另一种可行策略。通过各种报告物或横向流条，可以有效地消除通道间的干扰。
       有研究人员利用CRISPR-趾点（toehold）介导的链位移（TMSD）报告基因，开发了利用CRISPR-Cas12a系统检测多个靶点的CRISPR-TMSD平台。三个TMSD报告基因通过靶标激活的顺式切割作用被剪切产生不同的荧光信号从而实现多重检测。然而，这种方法存在灵敏度有限及不稳定的缺陷。Jonathan S等基于不同Cas酶对特定二核苷酸基序的特定切割偏好开发了SHERLOCKv2平台，通过LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a的正交性检测4个靶点。然而，该方法不足之处是在检测之前需要对靶标进行单独的RPA扩增。利用不同的Cas酶，Guk 等人则基于 CRISPR 正交提出了一种混合 CRISPR-Cas 系统，将 LbCas12a 和 LwCas13a混合并设计出不同的crRNA，可在一个锅反应中分别检测 DNA 和 RNA。
       虽然正交 CRISPR-Cas 系统实现了多重检测，但仍存在一些问题，如报告基因发射光谱的重叠和不同 Cas 酶对报告基因偏好的多样性，这些问题可能会限制正交酶和报告基因的使用，这些信号干扰或许可通过物理方法分离信号产生和接收过程来解决。

三、横向流动技术
       通过横向流动条来解决目标之间的信号干扰，也是常见实现多路检测目的的一种常见方式。例如，有研究人员进一步利用CRISPR-Cas9结合生物素和地高辛，在侧流条上同时检测到SARSCoV-2的两个片段基因。该技术大大提高检测的准确性和效率，适用于POCT。为了将多重检测平台应用到实际，Yin等人建立了一个针对SARS-CoV-2的多重基因诊断的自主纸质实验室平台。目标经3D打印RPA反应器放大后，打开蔗糖阀，进入每个检测室后激活CRISPR-Cas12a，实现多路检测。该平台的检测时间约为1h，实现了简单、低成本、自动、多基因检测。

图3 基于护理点测试平台的多路靶标检测策略

四、信号逻辑门
       逻辑门执行基本的逻辑功能，并根据其输入做出决策。基于CRISPR-Cas12a构建不同目标作为输入构建分子逻辑门，实现不同的信号响应，可以避免信号干扰，可应用于已建立的多路检测。
Gong等人提出了一种基于CRISPRCas12的生物传感平台的与逻辑门平台，用于同时检测肺癌患者中表达的miR- 944和miR-205。输入miRNAs时，AND逻辑门的输出信号为1。然后释放DNA（目标引物）引起体系产生可见的颜色变化。相反，在没有一种靶miRNA的情况下，逻辑门的输出为0。该方法巧妙地同时检测了两个目标，检测限可达到36.4 fM。

五、将CRISPR-Cas系统与其他技术相结合
       CRISPR-Cas系统与生物传感领域的其他技术相结合也可以形成多重靶标检测策略，包括PhC条形码、量子点和DNA四面体。
       有研究人员提出了一种基于生物启发的光子晶体（PhC）条形码的 CRISPR-Cas9 多重检测平台，将不同探针与具有独特波长的结构色条码结合后，不同的 PhC 条形码可以捕获并裂解 CRISPR-Cas9 系统识别的目标序列。该方法虽然灵敏度高但耗时长且操作复杂。利用高发光比色量子点，Green等人设计了一种核酸发夹（QDHP）分子信标，用于核酸的CRISPR-Cas定量检测。QDs 与基于 CRISPR 的检测相结合，拓宽了其应用范围。Zhan 等人则提出了一种基于 DNA 四面体（DNT）的 CRISPR 生物传感器，用于同时检测多重 HR-HPV-DNA，并进一步提高了灵敏度和缩短检测时间。

图4 CRISPR-Cas系统和其他技术相结合的多路靶标检测策略

六、其他多路复用的检测
       这种策略包括基于单锅CRISRP的多路复用检测和基于生物传感器的多路复检测。单锅CRISRP由于多引物引起的非特异性扩增和Cas蛋白不可区分的反式切割活性而增加检测的难度，往往需要结合别的技术以实现多路复用检测。对此，Shang等人设计了一个基于CRISPR-Cas13a和微流控液滴的多路检测平台来检测多种细菌，最终通过数字液滴读数获取检测结果。该平台缺点在于需要液滴芯片和专业操作，因此难以应用于现场检测。
       在基于生物传感器的多路复检测中，区分检测多个目标时产生的荧光信号仍然是一个挑战。Johnston 等人提出了一种多通道生物传感器BiosensorX，它结合了电化学技术将不同的检测方法固定在单通道微流体芯片上按顺序排列的孵育区，从而同时检测 SARS-CoV-2 的变种，适用于护理点检测。

       综上所述，在单个样本中实施基于CRISPR-Cas系统的多路检测策略可以通过提高检测效率来促进疾病的诊断。实现多路检测的第一个重要策略是与微流控技术相结合，该技术可以为具有相同信号的不同目标检测产生单独的空间。第二种是不同的Cas酶的正交反应，用不同的Cas蛋白识别不同的靶物质。此外，还可以设计新的材料和新的策略，与CRISPR-Cas系统同时检测多个目标。使用CRISPR系统的多路检测与其他技术或平台的集成对POCT具有巨大的潜力。
       此外，CRISPR-Cas系统介导的生物传感器多路检测仍然具有一些发展前景。例如，人们可以结合量子点等新材料开发新的生物传感平台，创建护理即时检测平台，或者通过设计DNA哑铃探针等方式开发CRISPR-Cas系统多路检测的特殊策略。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00161?ref=PDF

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