Prime Editing新动向-Prime editing提供疾病治疗新方法
Prime editing是一种基于CRISPR/Cas系统改进的基因编辑技术，可以在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换，具有更高的精确性和更低的误差率。 Prime editing一经问世，便引起许多科研工作者的广泛关注，被广泛用于遗传性疾病、基因突变型疾病和癌症治疗上的研究，如通过编辑患者的细胞基因组纠正致病的突变基因，从而治疗遗传性疾病，或通过编辑癌细胞基因组中的致癌基因，阻止其生长和扩散。本文选取了三篇prime editing相关研究的文章进行解读，为大家带来最新的prime editing研究动向。
一、Prime editing助力纠正人类类器官和气道上皮细胞中囊性纤维分裂引起的CFTR突变
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101544
囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种由跨膜传导调节蛋白（CFTR）双等位基因功能丧失突变引起的常见的遗传性致命疾病。过去已有多种CFTR调节剂疗法获得批准，但这些高效调节剂（HEMTs）只适用于至少有一个F508del等位基因或其他响应性CFTR突变的患者，无法为许多（超）罕见的CFTR突变患者提供治疗方法。随着科学研究发展，人们发现基因治疗能为这些突变提供了新的治疗机会。特别是最近开发的基于CRISPR的系统——prime editing（PE），为治疗遗传性疾病开辟了新的时代。Prime editing能够在患者的染色体上原位“重写”和纠正突变，提供了治疗单基因疾病如CF的新机会。
在这篇文章中，研究人员利用CRISPR-Cas9技术设计了针对CFTR基因中L227R和N1303K两种突变的prime editing策略，并在HEK293T细胞中构建了稳定表达3HA-L227R-CFTR和3HA-N1303K-CFTR的细胞模型来评估prime editing的效果。在开发的DETECTOR机器学习算法保证效率和准确率的情况下，研究人员进一步进行基因和功能校正的评估，结果显示编辑效率最高可达25%，纠正后的CFTR蛋白在糖基化、定位和离子通道功能方面得到了显著恢复。这些结果也在原代细胞模型试验中得到验证。此外，利用全基因组评估分析，研究员们并未发现显著的脱靶编辑事件，证明了prime editing的高保真度，并且该研究的临床相关性与安全性评估也得到通过。总的来说，这项研究展示了prime editing技术在纠正CFTR基因突变和恢复CFTR蛋白功能方面的潜力，为囊性纤维化的治疗提供了新的思路和方法。
图1 对c.680T>G (L227R)进行引导编辑
二、CRISPR prime editing协助生成人等基因诱导多能干细胞系
原文链接：https://doi.org/10.1089/crispr.2023.0066
随着人类分子遗传学和基因组学的发展，数千个与常见疾病风险相关的基因位点被识别出来，这些位点通常包含多个候选变异。然而大多数与疾病相关的变异是非编码的，这使得识别这些变异背后的分子机制变得困难。CRISPR技术的发展为靶向基因组编辑提供了更精确的方法，特别是prime editing，它可以介导几乎任何单核苷酸替换。因此许多研究员期望利用prime editing研究特定基因变异功能相关性中的应用并在多能干细胞中生成等基因系列，以控制遗传背景，同时评估因果等位基因的剂量效应。
在该文章中，研究员们开发了一种高效的CRISPR prime editing协议，用于在诱导多能干细胞（iPSC）中生成携带杂合或纯合等位基因的细胞系，并对prime editing技术进行优化。接着选择了与2型糖尿病（T2D）风险相关的六个单核苷酸变异（SNVs）进行编辑，并针对每个位点从遗传背景不同的人类供体衍生的iPSCs中进行编辑，通过系列实验和对比评估编辑效率。研究结果表明，研究员们成功生成了27个编辑过的iPSC克隆，涵盖了6个与2型糖尿病或先天性高胰岛素血症（CHI）相关的SNVs。他们还发现，prime editing技术在iPSCs中的效率比在HEK293T细胞中更高。总的来说，这项研究展示了prime editing技术在生成特定遗传背景的iPSCs中的潜力，并为研究特定遗传变异对疾病影响提供了一个有力的工具。
图2 引导编辑(PE3)组件及实验过程
三、患者造血干细胞体外prime editing挽救了移植小鼠后的镰状细胞病表型
原文链接：https://doi.org/10.1089/crispr.2023.0066
镰状细胞病（Sickle-cell disease, SCD）是一种由β-珠蛋白基因（HBB）中的一个A·T到T·A的点突变引起的常染色体隐性遗传病。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的唯一治愈SCD的方法是同种异体造血干细胞移植。然而，大多数患者缺乏理想的供体，并且该手术会导致严重的毒性。通过校正患者自身的造血干细胞（HSCs），可以绕过免疫并发症，并消除对组织相容性供体的需求。目前，已有一些关于使用Cas9核酸酶启动的同源定向修复（HDR）和腺相关病毒类型6（AAV6）递送的DNA模板来校正SCD突变的临床试验研究正在进行中。
在该文章中，研究员们利用优化的prime editing系统对SCD患者造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行体外校正，通过电穿孔将PEmax mRNA与合成的epegRNA和切割sgRNA结合使用，成功将SCD等位基因（HBBS）校正回野生型（HBBA），校正频率在15%到41%之间。之后，研究员们将经过启动编辑的HSPCs移植到免疫缺陷的小鼠体内，7周后，编辑的HSPCs在小鼠骨髓中维持了HBBA水平，并显示出与未编辑的健康供体HSPCs相似的植入频率、造血分化和谱系成熟。治疗效果评估发现，在移植后的小鼠中，平均42%的人红细胞前体和网织红细胞表达了HBBA，超过了预测的治疗益处水平。基因特异性分析也表明启动编辑系统具有高度的目标DNA特异性。最终研究结果证实了该技术手段的安全性和效率，具有长期效果和多克隆性。总结来说，这项研究展示了prime editing技术在治疗SCD中的潜力，证明了其在提高治疗效果和降低非目标编辑风险方面的有效性。
图3 SCD 患者 CD34+ HSPC 经先导编辑后移植到免疫缺陷小鼠体内后的移植情况
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