【文献解读】CRISPR/Cas9技术助力开发评估内源性胎儿血红蛋白诱导剂的细胞报告系统
胎儿血红蛋白（HbF）表达的再激活一直是治疗β-球蛋白病患者的药物发现工作的重点。随着CRISPR基因治疗的出现，HbF表达的再激活已成为一种有希望的治疗方法。为了测试潜在的HbF诱导剂，人们亟需一个能够在大量化合物中快速识别出潜在的HbF诱导剂的敏感、特异且高通量的筛选系统。在这种状况的驱动下，许多研究人员期望创建一个新的细胞报告系统来报告内源性HbF表达。最近，一组荷兰、德国和日本联合的研究人员成功开发这种细胞报告系统，其研究成果“A cellular reporter system to evaluate endogenous fetal hemoglobin induction and screen for therapeutic compounds”发表在HemaSphere（IF：12.1）杂志上。
球蛋白病是一组单基因疾病，包括镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血，其症状在出生后从胎儿血红蛋白（α2，γ2）转换为成人血红蛋白（α2，β2）时出现。血红蛋白从γ到β的转换在1948年已被观察到与症状的开始有关。从那时起，重新激活HbF表达被认为是这些患者有效治疗的一种方法。化合物羟基脲是唯一已被批准的胎儿血红蛋白表达诱导剂，但它在不同患者中的疗效差异较大，有些患者甚至对其没有响应或响应，这使得开发新药物迫在眉睫。之前已有的研究缺乏一个能够报告内源性HbF表达的细胞系，限制了对新诱导剂的评估和筛选。在该研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9技术在成人红细胞前体细胞系HUDEP2中插入一个生物发光标签，创建了第一个基于内源性标记的胎儿血红蛋白报告细胞系。最后，研究人员利用这个新的报告细胞系来评估遗传和药理策略诱导胎儿血红蛋白表达的效果，并通过高通量药物筛选来识别可能的HbF诱导剂。
一、HBG1特异性CRISPR-Cas9 gRNA设计的序列分析
胎儿γ-球蛋白链由两个几乎相同且间隔紧密的基因HBG1和HBG2编码。这两个基因之间的序列同源性很高，由 Cas9 诱导的双链断裂有可能在两个基因上同时发生，导致大的缺失或倒位。因此，CRISPR-Cas9介导的内源性胎儿γ-球蛋白链标记需要设计基因特异性的gRNA，使HBB位点上的其他β样球蛋白基因不受影响。为了设计特异性针对HBG1基因（编码Aγ球蛋白链）的CRISPR-Cas9 gRNA，研究人员首先对相关序列进行了分析。他们比较了人类参考基因组GRCh38中的HBG1和HBG2（编码Gγ珠蛋白链）的3'-UTR区域以及在HUDEP2细胞中进行基因特异性PCR扩增子测序。结果发现，在HBG1的3'-UTR中存在一个独特的核苷酸（位置+17）和一个额外的腺嘌呤（位置+55）；在HUDEP2细胞，3'-UTR中存在另外的基因特异性核苷酸。此外，在HUDEP2细胞中，位置+55的额外腺嘌呤是等位基因特异性的，而不是基因特异性的。利用这些序列信息，研究人员设计了两个特异性针对HBG1 3'-UTR的gRNA。通过将这些gRNA克隆到表达质粒中并转染到HEK293T细胞中，研究人员评估了它们的DNA切割效率。他们使用TIDE算法对Sanger测序迹线进行分析，发现gRNA #2的效率最高。
图1 在HUDEP2细胞中特异性靶向HBG1 3‘-UTR的gRNAs设计
二、标记HUDEP细胞中的内源性HBG1基因
在HUDEP细胞系中特异性标记内源性HBG1基因前，研究人员首先在类似胎儿的HUDEP1细胞中测试了CRISPR-Cas9介导的HBG1基因标记的可行性。他们将含有eGFP报告基因的双链DNA模板与Cas9_gRNA #2质粒共转染，尝试在HBG1基因上进行基因编辑。随后通过流式细胞术检测，结果发现敲入效率较低（GFP阳性细胞不到1%）。但是，正确编辑的细胞可以通过荧光激活细胞分选（FACS）进行富集。他们对FACS分选的细胞进行DNA序列分析，确认了eGFP标签正确地插入了内源性HBG1基因。为了获得一个更高效的敲入策略，研究人员在HUDEP2细胞中使用单链DNA模板和改进的Cas9-gRNA递送方法（使用RNP代替质粒），将HiBiT标签引入到Aγ-球蛋白的C末端。通过上述优化，敲入效率提高到超过20%。蛋白免疫印迹分析结果显示，克隆#10的细胞中，两个HBG1基因都含有HiBiT标签，并且与未标记的Gγ链相比，Aγ-HiBiT链作为一个慢迁移的条带被检测到。使用HiBiT发光信号检测蛋白免疫印记，结果显示只有慢迁移的Aγ-HiBiT条带被检测到，证实了HiBiT标签的特异性。通过重复上述过程，研究人员在不表达HbF的HUDEP2细胞中生成了含有HiBiT标签的报告细胞系，并通过分子特征和高通量筛选验证了该细胞系。
图2 HBG1基因的c端标记
三、Aγ-HiBiT报告细胞系在增殖和分化方面与HUDEP2细胞相似
为了确认新创建的Aγ‐HiBiT报告细胞系在生物学行为上与原始的HUDEP2细胞系是否具有相似性，特别是在细胞增殖和分化这两个关键的细胞过程，研究人员进行了系列验证。通过序列分析确认，Aγ‐HiBiT报告细胞系在其HBG1基因的A−等位基因上含有一个HiBiT标签的嵌入，而在A+等位基因上观察到一个插入突变，保留了TGA终止密码子。SNP阵列分析结果显示，报告细胞系除了HUDEP2细胞已知的染色体三体性（6, 8, 18, 19, 21号染色体）之外，还额外获得了7号染色体的副本。通过ATAC测序分析，他们发现报告细胞系在HBB位点的开放染色质模式与HUDEP2细胞相似，且HBE、HBG1和HBG2基因区域没有ATAC信号，表明这些基因仍然被有效沉默。对相关RNA进行测序，结果显示报告细胞系的转录活性限于成人HBD和HBB基因，与HUDEP2细胞的表达模式相似。此外，他们还比较了报告细胞系和HUDEP2细胞中已知的52个HbF调节因子的表达水平，对分化过程中的细胞表型变化进行分析。这些实验最终呈现的结果综合证实了Aγ‐HiBiT报告细胞系在分子和细胞层面上与HUDEP2细胞具有高度的相似性。
图3 Aγ-HiBiT报告细胞系的特性分析
四、应用Aγ-HiBiT报告细胞系评估遗传HBF-诱导策略
在创建了Aγ‐HiBiT报告细胞系后，为了更好地理解和操纵HbF的表达，以及开发新的治疗方法，研究人员进一步讨论如何应用Aγ‐HiBiT报告细胞系来评估遗传性HbF（胎儿血红蛋白）诱导策略。研究人员首先确认了Aγ‐HiBiT报告细胞系是否能够在基因编辑实验中存活。他们使用Cas9引导的gRNA针对HBG1和HBG2基因的启动子区域，通过CRISPR-Cas9系统在报告细胞中引入了一个已知与HPFH（遗传性胎儿血红蛋白持续存在）相关的13 bp缺失。在报告细胞和对照HUDEP2细胞中，通过基因组编辑后，观察到γ-珠蛋白蛋白水平的增加。蛋白免疫印记分析显示，在报告细胞中，经过基因编辑后，可以检测到HiBiT标记的以及未标记的γ-珠蛋白链。通过HPLC（高效液相色谱法）分析，发现基因编辑后，报告细胞群体中的HbF比例从约2.3%增加到23.1%。除了HBG1/2基因的编辑，研究还尝试了另一种遗传策略，即破坏BCL11A的红细胞特异性增强子，BCL11A是HbF的关键抑制因子。HiBiT Lytic Assay显示，在两种不同的遗传方法（HBG启动子编辑和BCL11A增强子破坏）后，报告细胞的HiBiT信号显著增加。
图4 使用Aγ-HiBiT报告细胞来评估遗传性胎儿血红蛋白（HbF）的诱导
五、泊马度胺作为HbF诱导的阳性对照化合物
为了发现能够诱导γ-珠蛋白表达的化合物，研究人员选择了泊马度胺作为诱导HbF的阳性对照化合物，并用其处理了健康捐赠者的原代红细胞前体细胞，以及来自镰状细胞病患者的原代红细胞前体细胞，以评估其对HbF表达的影响。首先，研究人员通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹分析，评估了泊马度胺处理后γ-珠蛋白mRNA和蛋白的表达水平。实验结果显示，泊马度胺处理可以显著增加原代红细胞前体细胞中HbF的水平，无论是在增殖条件下还是在分化条件下。此外，在进行化合物筛选时，化合物对细胞活力的影响也是研究人员需要考虑的因素。在发现泊马度胺在一定浓度范围内对细胞活力没有显著毒性后，研究人员测试了不同浓度的泊马度胺对Aγ-HiBiT信号的影响，发现存在剂量依赖性的增加，并估算了EC50值。为了验证泊马度胺是否特异地激活HbF，研究人员还测试了在分化条件下泊马度胺的效果，并与细胞毒性化合物进行了对比，以确保HbF的诱导不是由于细胞应激反应。
图5 使用泊马度胺作为胎儿血红蛋白（HbF）诱导的阳性对照
六、报告细胞系与HTS兼容
为了验证Aγ‐HiBiT报告细胞系是否适用于高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS），研究人员们进行了Aγ‐HiBiT报告细胞系与HTS的兼容性验证。在确定适合于高通量筛选（HTS）的Aγ‐HiBiT报告细胞系的培养条件后，研究人员在384孔板中测试不同的细胞接种密度，发现10,000至15,000个细胞每孔能够在3天内线性增殖。接着，研究人员使用泊马度胺的不同浓度对细胞进行处理，以测试Aγ‐HiBiT信号的剂量依赖性反应。针对自动化读取过程中出现的问题，他们优化了实验操作，包括减少裂解缓冲液的体积和调整添加速度。通过筛选一个包含5632种已知化合物的库，研究人员们验证了Aγ‐HiBiT报告细胞系在HTS中的适用性。在筛选中成功鉴定了已知的HbF诱导剂地西他滨（Decitabine），以及其他核苷酸类似物，证明了细胞系在识别HbF诱导剂方面的有效性。通过DMSO溶剂毒性研究，研究人员确定了Aγ‐HiBiT报告细胞系对DMSO溶剂的敏感性，并建议在HTS中使用低浓度DMSO以避免影响细胞活力。这些实验结果最终证实Aγ‐HiBiT报告细胞系与HTS兼容，并可以作为一个强大的工具用于无偏地识别新的HbF诱导化合物。
图6 Aγ-HiBiT 报告细胞系适用于旨在检测血红蛋白 (HbF) 诱导的高通量筛选 (HTS) 应用
综上，这项研究报道了一个创新的Aγ‐HiBiT报告细胞系的开发，该细胞系利用CRISPR-Cas9基因敲入技术在成人红细胞前体HUDEP2细胞中特异地标记了胎儿血红蛋白（HbF）基因。这一系统能够高灵敏度和特异性地监测内源性HbF的表达，适用于高通量药物筛选，以鉴定新的HbF诱导剂。这项工作为β-球蛋白病的治疗研究提供了新的工具，有助于推动新治疗方法的发展。
原文链接：https://doi.org/10.1002/hem3.139
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