【文献解读】CRISPR筛选揭示去除TREX1可增强CRISPR-Cas9介导的同源定向修复效率

      CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复（HDR）是在目标基因组位点引入精准突变的关键技术。然而，实现高 HDR 效率仍是一项挑战，尤其是在 DNA 修复活性不足的细胞类型中。在大多数人类细胞中，HDR 会在 CRISPR-Cas9 介导的双链断裂（DSB）修复过程中引入外源 DNA 序列，但与非同源末端连接（NHEJ）相比，HDR 的效率明显较低。细胞周期阶段、基因差异表达和细胞背景等因素都会影响 HDR 的效率。此外，DNA 修复基因突变的患者细胞，如范可尼贫血症（FA），会降低 HDR 的效率，从而使基因组编辑的过程更加复杂。

     为了找出限制CRISPR-Cas9介导HDR的因素，尤其是在FA患者等特定细胞中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院和纪念斯隆·凯特琳癌症中心的研究人员做了一系列的实验，他们从来自范可尼贫血症患者的淋巴母细胞系中进行了全基因组CRISPR筛选，其研究成果“Removal of TREX1 activity enhances CRISPR–Cas9-mediated homologous recombination”发表在 nature biotechnology (IF:33.1)杂志上。研究人员发现，外切酶 TREX1 会显著影响 HDR 效率，敲除 TREX1 或使用化学保护 DNA 模板可以重新激活表达 TREX1 细胞的 HDR 效率。这项研究提出了加强CRISPR-Cas9介导HDR的策略，尤其是在TREX1高表达的情况下。

一、去除 TREX1 可重新激活 FA 患者细胞中的 HDR

      该研究使用BFP-to-GFP报告系统，评估了CRISPR-Cas9介导的FANCA-/-和FANCD2-/-患者淋巴母细胞系（LCLs）的HDR效率，用Cas9核糖核蛋白（RNPs）和单链寡核苷酸（ssODN）模板诱导BFP-His151向GFP-Tyr151转化。初步实验表明，FA-LCLs的HDR效率明显低于野生型，尤其是在FANCA-/-细胞中（例如FANCA-/- 0.3±0.2%，FANCD2-/- 2.3±0.6%，WT 9.1±0.7%）。为了揭示调节 FANCA-/- 细胞 HDR 的因素，研究者利用 CRISPR 抑制（CRISPRi）和 CRISPR RNPs 系统进行了全基因组范围的CRISPR筛选，并结合荧光激活细胞分选（FACS）技术将BFP 转化为 GFP并对回收的 sgRNAs 进行 测序。在进行慢病毒工程和电穿孔之后，分离出了大约 0.5% 的 GFP+，sgRNAs二代测序（NGS）结果显示，TREX1 基因在具有高 HDR 活性（FDR < 1 × 10^-7）的细胞中显著富集，表明它是 FANCA-/- 细胞 HDR 的关键调控因子。

图 1 TREX1 是 CRISPR-Cas9 介导 HDR 的限制因子

二、TREX1 破坏未受保护的 HDR 模板稳定性

      TREX1是一种锚定在ER外膜上的3′-5′外切酶，在抑制细胞膜DNA先天免疫反应过程中，慢性激活环化GMP-AMP合成酶（cGAS）的途径上起着关键作用。TREX1主要降解单链和双链DNA，TREX1的突变与Aicardi-Goutières综合征等自身免疫性疾病有关。在这项研究中，TREX1被确定为限制FANCA-/-细胞中CRISPR-Cas9介导HDR的关键因素。在FANCA-/-和FANCD2-/-细胞中敲除TREX1可重新激活HDR，而过表达的野生型TREX1则几乎完全削减HDR。随后的实验证实，TREX1 与单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）相互作用，在核扩散之前降解细胞质 DNA 模板，从而直接降低了 HDR 的效率。在 HeLa 细胞和 RPE-1 hTERT 细胞中进行的 CRISPR-Cas9 编辑证实了这种外切酶的活性，结果表明保护 ssODN 的 3′ 端可显著提高各种细胞类型中的 HDR 效率，突出了 TREX1 在基因组编辑过程中起到限制模板稳定性的作用。尽管TREX1与ssODN有很强的关联，但它在DNA损伤后并没有转移到细胞核中，这表明它在限制HDR方面的主要作用仍在细胞质中。

图2 TREX1 与 ssODN HDR 模板相互作用

三、TREX1 限制了多种细胞背景下的 HDR 效率，模板保护可规避此现象

      该研究探讨了 TREX1 对不同人类细胞类型中 CRISPR-Cas9 介导 HDR 的影响，发现 TREX1 高表达的细胞系（如 HeLa）的 HDR 效率较低，相反，K562 和 HEK293 等 TREX1 低表达细胞的 HDR 水平较高。通过 CRISPRi 敲除 TREX1 或使用受保护的 ssODN，研究人员提高了 TREX1 表达细胞的 HDR 效率。研究人员将这些发现延伸到原代人类细胞中，结果表明，受保护的ssODN能显著提高造血干细胞（HSPC）和活化T细胞的HDR，但对诱导多能干细胞（iPSC）的影响微乎其微。此外，T细胞中的TREX1基因敲除提高了未受保护的ssODN模板的HDR，因此它们的表现与受保护的ssODN模板相似。这些结果表明，TREX1 是细胞中 HDR 的关键调节因子，ssODN 保护或 TREX1 抑制等策略可以提高不同细胞类型的 CRISPR-Cas9 编辑效率。此外，研究者还强调了将 TREX1 抑制与其他 HDR 增强方法（如 DNA-PKcs 抑制剂 AZD7648）相结合，以进一步提高基因编辑的效率。

图3 TREX1在表达 TREX1的原代细胞中抑制HDR

四、HDR 供体类型影响 TREX1 的活性

      除了单链寡核苷酸（ssODN）模板之外，这项研究还扩大了研究范围，研究了TREX1对基因组编辑中使用的各种DNA供体类型的影响。研究人员考察了TREX1对环状和线性双链DNA（dsDNA）以及重组腺相关病毒（rAAV）供体的影响，这些供体通常用于插入大型DNA载体。通过在TREX1抑制型和野生型HeLa细胞中使用质粒dsDNA供体进行基因编辑实验，研究人员发现，共价封闭质粒模板的HDR效率不会受到TREX1抑制的显著影响。然而，当使用线性PCR扩增的dsDNA供体时，TREX1抑制能显著提高HeLa细胞和Jurkat细胞的HDR效率，这表明当DNA供体具有游离的3′末端时，TREX1的表达会影响HDR效率。TREX1 在 K562 细胞中的过表达进一步证实了这一点，因为它大大降低了ssODN 模板的 HDR 效率。研究人员还探讨了 TREX1 在 rAAV 供体介导的 HDR 中的作用，结果发现虽然 TREX1 的过表达会降低 ssODN 模板的 HDR，但它对 AAV 供体的影响较小，因为 AAV 供体能将 DNA 载体送入细胞核，理论上应保护细胞核不受 ER 定位的 TREX1 的影响。然而，长时间暴露于 AAV 供体确实会降低表达 TREX1 细胞的 HDR。这些数据有力地证明了 TREX1 是 CRISPR-Cas9 介导的 HDR 的主要调节因子，尤其是对于线性、无保护的 DNA 供体分子，而对 DNA 模板 3′ 端进行化学保护可以规避 TREX1 的活性。

图4 TREX1对各种类型的 HDR 供体具有不同的活性

      总之，这项研究发现，TREX1作为一种外切酶，影响着人类细胞中CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）效率，尤其是在那些TREX1水平较高的细胞中，如范可尼贫血症（FA）细胞和多种永生细胞系。为了解决这个问题，移除 TREX1 或使用化学保护的单链 DNA 模板可以显著提高 TREX1 含量高的细胞 HDR 效率。这项研究表明，保护 HDR 模板的末端可以使它们不受 TREX1 的影响，从而提高 HDR 和 CRISPR 基因编辑的效率，并强调了 TREX1 作为模板保护生物标记物的重要意义，在推进 CRISPR 治疗策略上具有巨大潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02356-3

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