【文献解读】 CRISPR基因敲除细胞技术助力肾病治疗：激活Nrf2，开启肾脏保护新篇章
急性肾损伤（AKI）是一个全球性的重大医疗问题，与死亡率和发病率的增加有关。其中，缺血再灌注损伤（IRI）是AKI的主要原因，由肾脏血流暂时减少引起。然而，目前尚无针对AKI的特定疗法。以CD4+ T细胞为代表的免疫细胞，在肾脏IRI早期损伤和修复过程的发病机制中起着至关重要的作用。核因子红细胞2相关因子2/kelch-like ECH相关蛋白1（Nrf2/Keap1）通路是肾脏疾病的一个有前景的治疗靶点。目前，研究人员正在积极探索Nrf2在肾脏疾病中的作用，药理学Nrf2激活剂已在临床试验中摸索，但仍面临着副作用的挑战。先前的研究证实了Nrf2的激活对肾脏 RI的保护作用，但T细胞特异性Keap1缺失的作用仍有待充分阐明。
为了研究Nrf2/Keap1通路是如何在肾脏IRI中起保护作用，来自美国约翰·霍普金斯大学医学院的研究人员做了一系列的实验，证实了CRISPR/Cas9介导的基因编辑在增强CD4+ T细胞中Nrf2活性方面起到了重要作用，让其成为肾脏IRI的新型治疗方法。其研究成果“T Cell Nrf2/Keap1 Gene Editing Using CRISPR/Cas9 and Experimental Kidney Ischemia-Reperfusion Injury”发表在Antioxid Redox Signal (IF:5.9)杂志上。
CRISPR/Cas9基因编辑是一种强大的靶向基因编辑技术，已成功用于在人类T细胞中进行Keap1-KO，从而导致Nrf2靶基因上调。研究表明，小鼠T细胞特异性Keap1缺失（CD4-Keap1基因敲除[KO]）可提供针对肾脏IRI的结构和功能保护。此外，从Nrf2活性增加的Keap1-KO小鼠过继转移T细胞，可保护野生型小鼠免受肾脏IRI的侵害。这项研究表明，在小鼠CD4+ T细胞中使用CRISPR/Cas9技术进行体外Keap1敲除，可上调Nrf2依赖性抗氧化剂靶基因，并提供针对肾脏IRI的功能保护。
一、使用CRISPR/Cas9技术敲除Keap1增强Nrf2靶基因表达
为了研究Keap1-KO对小鼠CD4+ T细胞中Nrf2靶基因表达的功效，研究人员针对Keap1基因的不同位点，采用了三种不同的sgRNA进行单独或组合测试。培养小鼠原代CD4+ T细胞，然后递送由sgRNA和Cas9组成的核糖核蛋白（RNP）复合物，在电穿孔后收获细胞，并通过量化Nrf2靶基因表达来评估Keap1-KO的功效。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，对于所有测试的sgRNA，无论是单独还是组合，在电穿孔24小时后，Nqo1、Hmox1和Gclc水平均显着增加。sgRNA3被选为后续实验对象，因为它具有提高Nqo1 mRNA表达和显着上调Hmox1和Gclc mRNA表达的优越能力。此外，研究人员还检测了促炎和抗炎细胞因子的mRNA表达，确定RNP电穿孔24小时后，Keap1-KO可能引起的免疫学改变。与对照细胞相比，Keap1-KO CD4+ T细胞中Tnfa的表达显著上调，而Ifng、Il17和Il10的mRNA表达与对照CD4+ T细胞之间无显著差异。
图1 Keap1敲除CD4+ T细胞及其对小鼠模型中缺血再灌注诱发AKI的影响的图示
二、Keap1敲除导致抗氧化基因的持续表达
为了研究延长培养时间对Keap1-KO CD4+ T细胞中Nrf2靶基因表达的影响，在电穿孔后，研究人员将对照组和Keap1-KO组的CD4+ T细胞培养时间延长至96小时。通过qRT-PCR评估抗氧化基因表达，结果发现，与对照细胞相比Keap1-KO T细胞中Nrf2靶基因Nqo1、Hmox1、Gclc和Gclm的表达显著且持续上调。结果表明，使用CRISPR/Cas9的Keap1-KO可导致持续的Nrf2激活。
三、免疫印迹分析并证实Keap1敲除
研究人员对RNP电穿孔96小时后的CD4+ T细胞进行了免疫印迹分析，评估CRISPR/Cas9介导的Keap1敲除对其蛋白表达的影响。结果显示，与对照CD4+ T细胞相比，Keap1敲除的CD4+ T细胞中Keap1蛋白表达显著降低，同时，Nqo1蛋白表达在Keap1编辑的细胞中高出50%。这些结果证实了CRISPR/Cas9在体外成功抑制了Keap1-KO CD4+ T细胞中Keap1蛋白的表达，且使得Nrf2靶基因表达上调。
图2 在电穿孔24小时后，CRISPR/Cas9介导的Keap1基因敲除增加了培养小鼠的CD4+ T细胞中Nrf2调节的抗氧化剂和细胞因子基因表达
四、Nrf2的持续增强不会诱导CD4+ T细胞的活化或衰竭
为了研究Nrf2持续的活性是否会诱导CD4+ T细胞的活化或衰竭，研究人员使用流式细胞技术和qRT-PCR对Keap1-KO CD4+ T细胞进行分析。在 72 小时的时间点，研究人员观察到 FoxP3 的表达与对照细胞之间没有差异，而且，活化标志物CD25和CD69在两组之间的表达水平也相当。此外Keap1-KO与对照细胞之间TNFa、IFNc、IL17和IL10的细胞因子表达也没有显著差异。
此外，为了确定CRISPR/Cas9敲除Keap1是否会导致离体培养的CD4+ T细胞衰竭，研究人员进一步对共抑制分子的表达进行了评估。结果表明，与对照组相比，在Keap1-KO T细胞中，未观察到与T细胞衰竭相关的共抑制分子起到影响作用。
图3 体外常氧和缺氧条件下，对照细胞和Keap1-KO CD4+ T细胞中的细胞因子和趋化因子表达
五、在体外常氧和缺氧条件下，CD4+ T细胞的Keap1敲除改变了其细胞因子和Nrf2靶基因的表达
为了阐明Nrf2抗氧化的活性增强对肾脏缺血损伤期间肾脏中CD4 + T细胞的影响，研究人员将细胞暴露于体外缺氧条件下展开实验。在常氧和缺氧条件下，与对照细胞相比，Keap1-KO CD4 + T细胞中Nrf2的靶基因Nqo1，Hmox1和Gclm的mRNA水平皆显著增加。然而，在常氧和缺氧条件下，各组之间缺氧诱导因子1α（Hif1a）和B细胞淋巴瘤2（Bcl2）的表达并没有显著变化。
此外，研究人员还对Keap1-KO CD4 + T细胞的培养上清液进行了流式微珠阵列（CBA）分析，并发现与未编辑的对照细胞相比，Keap1-KO中的IL2和IL6在常氧和缺氧条件下均显着降低。此外，在缺氧条件下，IFNc水平显著升高，而在常氧条件下，Il6水平降低。
图4 Keap1-KO CD4+ T细胞的过继转移可实现对IRI的功能保护
六、Keap1-KO CD4+ T细胞免疫治疗改善患有IRI的肾功能
为了评估Keap1-KO CD4+ T细胞免疫疗法在小鼠肾脏IRI模型中的治疗潜力，研究人员将Keap1-KO或对照CD4+ T细胞过继转移到nu/nu小鼠体内，随后进行IR手术。与转移了对照CD4+ T细胞的小鼠相比，结果显示，Keap1-KO CD4+ T细胞受体小鼠的血浆肌酐水平显着降低，而各组之间外髓质坏死小管没有显着差异。此外，受体肾脏的免疫表型分析证实，过继转移的CD4+ T细胞成功转运到了肾脏，并且与对照细胞相比，Keap1-KO CD4+ T细胞中CD25的表达显着降低，TNFa也有降低的趋势。然而，从缺血后肾脏分离的Keap1-KO细胞，其CD69表达或细胞内IFNc水平并没有差异。对受体小鼠肾脏的CD4+ T细胞的分析也显示FoxP3信号极弱，这可能是由于细胞数量少造成的。
图5 确认受体肾脏的过继转移和免疫表型
综上所述，该研究证明了CRISPR/Cas9介导的基因编辑在增强CD4+ T细胞中Nrf2活性方面起到了重要作用，让其成为肾脏IRI的新型治疗方法。Nrf2/Keap1通路是肾脏疾病的重要治疗靶点，通过破坏负向调控Nrf2的Keap1基因。研究人员利用CRISPR敲除技术构建了具有增强抗氧化能力的Keap1-KO CD4+ T细胞，它能 持续激活Nrf2，并上调抗氧化基因，而将这些细胞过继转移到患有肾脏IRI的nu/nu小鼠体内可改善肾功能。这项研究凸显了通过CRISPR/Cas9技术精准敲除基因、创建具有所需治疗特性的基因工程细胞的巨大潜力，为治疗各种肾脏疾病提供新思路。
原文链接：https://doi.org/10.1089/ars.2022.0058
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