【文献解读】 CRISPR革新检测：CreDiT新技术为资源匮乏地区健康服务续航
全球范围内由HPV引起的癌症在低中收入国家（LMICs）的发病率显著高于其他国家，占了80%以上的比例。及时并精准地识别高危型人乳头瘤病毒（hrHPV），对于解决病理学瓶颈以及克服这些资源匮乏地区中宫颈癌筛查的地理、社会经济障碍来说至关重要。与传统的细胞学相比，以PCR为代表的分子诊断法具有更高的灵敏性和特异性。然而，它的高成本和高基础设施要求限制了其在中低收入国家的可行性，开发即时诊断（POC）解决方案来支持“筛查和治疗”方法尤为迫切。
基于CRISPR的检测技术已经成为核酸（NA）检测的有力工具，因为它们能够实现序列特异性信号放大。来自美国马萨诸塞州总医院研究所系统生物学中心的研究人员基于CRISPR系统开发了一种即时检测（POC）技术---CreDiT（CRISPR增强数字检测），专门用于分散的HPV检测和筛查HPV相关癌症。他们的成果发表在Nature Communications（IF：14.7）杂志上，标题为 “Empowering the on-site detection of nucleic acids by integrating CRISPR and digital signal processing”。
CreDiT将Cas反应与数字无线电通信信号读出方式相结合，提供快速、恒温、单管检测，具有稳健、抗噪声的信号检测优势。该技术旨在检测高危HPV基因和癌蛋白mRNA，可同时处理多达12个样本，在35分钟内精准检测低至单拷贝的HPV DNA靶标，并对临床宫颈和肛门样本中的高危HPV类型进行分类。CRISPR CreDiT检测的多功能性使其成为临床诊断极有价值的工具，尤其是在资源有限的环境中。
一、CreDit 平台的构建
CreDiT是一种无需外部中断，可同时扩增目标 DNA 和分析信号的创新一体化检测方法。在 CreDiT 的初始阶段，聚合酶分离双链靶 DNA，形成一个单链区域供 gRNA 分子识别。这种识别触发 Cas12a 酶的核酸酶活性并使其切割 F-Q DNA 探针，产生荧光信号。整个检测过程可在固定温度下进行，确保高效的样品处理。为了方便现场测试，研究人员还开发了一种专门用于多样品测量的自动测试系统，可确保信号检测的一致性。该系统外形小巧，尺寸仅为 14 × 11 × 6.5 cm3。这种自动 CreDiT 检测方法有望在资源有限的环境中进行床旁检测，满足对快速、精准 hrHPV 检测的需求，尤其是在服务不足的地区。
图1 CreDiT用于人乳头瘤病毒检测
二、用于 POC 操作的光学检测
要设计出理想的护理点（POC）设备，应通过使用更少的组件来降低设计复杂性和成本，但这往往会影响系统准确性和分析性能，尤其是荧光设备。和简单的光学设置相比，CreDiT光学系统利用沃尔什-哈达玛德变换 (WHT)，本质上与数字电子设备兼容，采用快速、轻便的算法（FWHT），只需实数加减便可完成。WHT 的性能优于恒定照明和锁定技术，灵敏度高，检测限低于传统方法约2200倍，同时与商业读板器的检测结果具有很强的相关性。
三、CreDiT 温控
为确保 CreDiT 反应的一致性，研究人员为检测装置设计了精确的温度控制。研究人员优化了样品支架的设计，以便对所有 12 个样品进行快速、均匀的加热。此外，还设计了铝制支架，以确保装置比固体支架加热更快。在这基础上，他们确定了一个适应不同化验步骤的精确温度。在整个化验过程中观察到一致的热量分布，证实了所有 12 个样品的温度均一性。
图2 CreDiT系统的构建
四、POC 操作的化验优化
为了优化 CreDiT 检测的工作流程，研究人员使用酶细胞消化法对核酸提取过程进行了微调，这种方法无需外部仪器，只需调节温度即可控制。研究人员将这种优化方案与标准提取方法进行了比较，对两种方法提取的核酸都进行了 PCR 和 CreDiT 分析。结果发现，两种方法提取的核酸质量、PCR条带强度、提取率上都较为相似。
此外，研究人员还探讨了在环境温度下储存样本和试剂的可行性，这是在中低收入国家（LMIC）部署 CreDiT 的一个重要考虑因素。他们在 4°C 或环境温度下将细胞保存在提取缓冲液中，发现核酸产率至少两周都没有明显下降。此外，为了便于储存和运输，他们将预先混合好的 CreDiT 试剂冻干，结果表明试剂在环境温度下至少能保持两周的有效性。这些研究结果表明，CreDiT 可在资源有限的环境中使用，无需冷链解决方案，从而提高了其实用性和可行性。
图3 POC应用的检测优化
五、CreDiT 探针的设计与验证
研究人员针对特定的 DNA 序列开发了一个全面的 CreDiT 探针库，用于检测高危 HPV (hrHPV)。在验证过程中，他们对检测试剂进行了优化。结果表明，只有当所有成分和目标 DNA 都存在时，才会出现 CreDiT 信号。研究人员将CreDiT与 qPCR 、合成 HPV16 DNA 的两步检测法进行性能上的比较，结果显示，CreDiT 具有更高的灵敏度。CreDiT 的检测时间也更快，只需 20 分钟，而 qPCR 需要 1 小时，两步检测法需要 50 分钟。经 CreDiT 检测和凝胶电泳验证，CreDiT 表现出高度特异性和极低的交叉反应，证实了其作为一种稳健、灵敏的 hrHPV 检测诊断工具的潜力。
图4 CreDiT 探针设计
六、CreDiT 方法确证
为了评估 CreDiT 与其他检测方法的一致性，研究人员对整个 CreDiT 检测流程进行了评估。他们应用不同 HPV 亚型的宫颈癌细胞系来评估更多的 hrHPV 探针，CreDiT只检测到了目标信号。此外，CreDiT 还通过加入逆转录酶用于 mRNA 目标检测，在定性和定量分析中产生与 RT-PCR 一致的结果，从而有助于识别高危病例并最大限度地减少过度治疗。
七、CreDiT 临床测试
在研究的最后阶段，研究人员用 CreDiT 检测来分析从宫颈或阴道涂片标本中提取的样本。研究人员采用 qPCR 方法对样本进行 HPV 状态评估，并对残留样本进行 CreDiT 检测。CreDiT 能精准区分 HPV 阳性和阴性样本，并识别出三种主要的 hrHPV 类型（HPV16、HPV18 和 HPV45），与临床诊断结果一致。
对于三种主要的 hrHPV 目标，CreDiT 表现出极高的诊断观察准确性。为了证明 CreDiT 的临床应用范围，研究人员还对肛门巴氏试验样本进行了分析。在肛门癌病例的 HPV 检测中，CreDiT 的结果再次显示出与临床诊断的极佳一致性。这些结果凸显了 CreDiT 作为可靠、精准的 HPV 筛查工具在各种临床环境中的潜力。
图5 使用细胞样本进行 CreDiT 表征检测
图6 临床样本分析
综上，基于 CRISPR 的 CreDiT 旨在为低收入国家提供低成本、分散化、自动化和快速读取结果的分子诊断。它的设计具有几个主要特点：首先CreDiT 的灵敏度是 PCR 的 100 倍，以单管形式运行，并保持 42°C 的恒温。其次，该系统无需 PAM 序列，可检测多种 hrHPV 目标，从而适应各种临床需求。此外，新型数字方法的使用提高了信噪比和计算效率，使 CreDiT 更适合于床旁应用。
然而，要进一步提高 CreDiT 的实用性，未来还将面临更多挑战。在这项研究中，研究人员提出了更多的见解，包括扩大探针库以检测更广泛的人乳头瘤病毒亚型、在单个反应管内进行多重检测，以及简化检测工作流程，以方便使用。最终目标是将 CreDiT 部署到低中收入国家进行实际评估，与当地医疗供应商的合作，帮助完善该平台，确保其满足这些地区特定的临床、经济和环境需求。最终，CreDiT 将使 CRISPR 检测成为一种实用的、可实地部署的 HPV 检测解决方案，使最有需求的地区也能进行最先进的筛查。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50588-3
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