【文献解读】CRISPR敲除筛选揭示CENP-E介导的细胞分裂新机制
染色体的正确排列和分离对于维持动物的染色体稳定性非常重要。中心粒相关蛋白E（CENP-E，Centromere-associated protein E）等有丝分裂驱动蛋白在调控微管、纺锤体结构以及染色体对齐中起到了关键作用。作为一种驱动蛋白7的马达蛋白，CENP-E会在G₂期后期积累，并在有丝分裂中负责连接动粒和微管，还调控纺锤体组装检查点的功能。如果减少CENP-E的表达，染色体就会错位，激活有丝分裂检查点；而完全敲除CENP-E则会导致细胞周期停止，甚至导致细胞死亡。为了确保染色体的正确排列和分离，CENP-E与动力蛋白（Dynein）和Aurora B等蛋白共同作用，充当染色体和动粒纤维之间的连接器。BubR1蛋白会招募CENP-E来激活纺锤体组装检查点，不过CENP-E缺失对这一检查点的具体影响仍有待进一步研究。
为了解决这一问题，来自福建医科大学和福建省妇幼保健院的研究人员采用了CRISPR-Cas9基因编辑技术，结合高通量筛选、化学抑制以及先进的显微技术，研究了CENP-E在染色体排列和稳定性中的关键作用。研究结果发表于期刊Cell Proliferation，题为“Kinesin-7 CENP-E mediates centrosome organization and spindle assembly to regulate chromosome alignment and genome stability”。研究结果表明，抑制或敲除CENP-E均会导致染色体错位、纺锤体紊乱以及染色体分离缺陷。此外，CRISPR-Cas9敲除CENP-E导致染色体聚合和排列严重受损，触发了纺锤体组装检查点的激活，并引发细胞周期停滞。这些发现有助于更全面地理解CENP-E在维持染色体排列和调控细胞周期进程中的分子功能。
一、CENP-E抑制会导致染色体错位、CENP-E定位异常以及多极纺锤体的形成
CENP-E蛋白在细胞分裂前的G₂/M期大量表达，首先在前中期和中期定位于动粒（kinetochores），随后在后期和胞质分裂过程中转移到中央纺锤体。为了研究CENP-E在HeLa细胞中的作用，研究人员使用了特异性抑制剂GSK923295，该药物阻断了CENP-E的ATP酶活性，使其无法在微管上正常移动。结果显示，CENP-E的抑制导致染色体在纺锤体两极发生显著的错位，纺锤体变短，宽度增加。研究还发现，染色体错位的程度与GSK923295的浓度呈正相关，表明CENP-E抑制具有剂量依赖性。荧光分析进一步揭示，随着抑制剂浓度增加，CENP-E在错位染色体动粒处的积累加剧，而在已对齐的染色体动粒处CENP-E的分布则显著减少。
在HeLa细胞中，CENP-E的抑制还扰乱了正常的细胞周期进程，导致间期细胞减少，中期细胞增多，而后期细胞数量减少。此外，CENP-E的抑制增加了双极和多极纺锤体的发生率，这表明纺锤体的组装存在缺陷。通过测量γ-微管蛋白的区域和荧光强度，研究发现CENP-E的抑制导致中心体分散，并且纺锤体极上的γ-微管蛋白浓度降低，进一步影响了纺锤体的组织结构。这些结果强调了CENP-E在染色体对齐、纺锤体组装及细胞分裂过程中不可或缺的作用。
图 1 CENP-E 抑制导致染色体错位和 CENP-E 蛋白在分裂期的异常定位
二、CENP-E缺失导致染色体错位和中心体紊乱
为了研究CENP-E在细胞分裂中的具体功能，研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑技术生成了CENP-E敲除的HeLa细胞系。在用CENP-E特异性sgRNA转染HeLa细胞后，研究人员在CENP-E基因位点引发了双链断裂，并通过非同源末端连接（NHEJ）诱导内源性DNA修复，从而导致随机插入、缺失和替换。在实验中，研究人员创建了CENP-E+/-杂合子和CENP-E-/-敲除克隆。在敲除克隆中，CENP-E蛋白的完全缺失导致染色体显著错位，染色体异常集中在纺锤体两极附近。相比之下，CENP-E+/-杂合子细胞中，染色体分布更加分散。统计分析证实，CENP-E的缺失导致染色体错位程度增加，并在纺锤体极附近呈现出更为分散的染色体组织。
在CRISPR-CENP-E-/-敲除细胞系的进一步研究中，研究人员还揭示了CENP-E在细胞分裂前中期和中期的作用。通常情况下，CENP-E蛋白在前中期时积累于动粒和纺锤体微管上，但在中期时会从已对齐的动粒上解离。然而，当CENP-E被抑制或敲除时，这些蛋白质仍留在错位的染色体上。在CENP-E-/-细胞中，完全敲除导致多极纺锤体的形成，纺锤体极之间的距离增大，并导致中心体紊乱，包括γ-微管蛋白标记的中心体分散以及k纤维宽度的减少。免疫荧光分析进一步揭示了纺锤体极动态的变化，突出了CENP-E在维持纺锤体极组织、中心体完整性以及中期k纤维组装中的关键作用。
图 2 利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建 CENP-E 基因敲除 Hela 细胞
三、CENP-E在体内对于纺锤体组织、染色体对齐和细胞周期进程至关重要
在该研究中，研究人员发现CENP-E的缺失导致KIF2C蛋白在错位的动粒上积累，特别是在纺锤体极附近。此外，CENP-E缺失还导致BubR1蛋白在对齐的动粒上定位减少，而在中期时错位的动粒上BubR1的表达量增加。研究还发现Mad1蛋白在CENP-E+/-和CENP-E+/+细胞的错位动粒上积累，表明Mad1相关的纺锤体组装检查点被激活。在CENP-E敲除杂合小鼠的体内实验中，研究表明CENP-E的缺失导致淋巴细胞凋亡增加，表现为脾脏中TUNEL阳性和pHH3阳性细胞的增多，尽管脾脏重量未受影响。此外，CENP-E的缺失还导致染色体错位和纺锤体紊乱，进而增加了分裂中的淋巴细胞和凋亡细胞的数量。
研究人员还进行了细胞克隆形成实验，结果显示CENP-E的缺失显著减少了HeLa细胞克隆的数量和直径，表明细胞增殖受到抑制。与对照组相比，CENP-E+/-和CENP-E-/- HeLa细胞每个克隆中的细胞数量减少，而CENP-E-/- HeLa细胞的间期和中期细胞数量增加。细胞周期分析显示，CENP-E缺失后G2/M期细胞显著增加，半量不足（CENP-E+/-）也导致这些细胞的轻微增加。此外，细胞凋亡分析表明，CENP-E缺失后早期和晚期凋亡细胞的数量均有所增加。综上所述，这些研究结果表明CENP-E缺失导致细胞周期停滞、细胞生长受抑以及细胞凋亡增加。
图 3 CENP-E 蛋白在野生型、GSK923295 抑制型和 CENP-E 基因敲除型细胞中的动态定位模式
四、CENP-E对细胞增殖、细胞周期控制和染色体稳定性至关重要
通过对HeLa细胞系的染色实验，研究人员探讨了CENP-E缺失后染色体错位的影响。结果显示，在CENP-E-/- HeLa细胞中，Aurora B蛋白发生了在纺锤体上的易位。有趣的是，CENP-E+/-和CENP-E-/- HeLa细胞在末期均表现出染色体滞后和靠近中体的染色体断裂。CENP-E缺失后，中体的结构受到影响，中体处Aurora B的总荧光强度显著增加。此外，研究还发现，CENP-E的缺失导致CENP-E+/-和CENP-E-/- HeLa细胞中的微核形成增加。
图4 CENP-E缺失导致多极纺锤的形成和纺锤极的紊乱
总而言之，作为一种正端驱动的马达蛋白，CENP-E在细胞分裂过程中对于染色体的双向定位、聚合和对齐至关重要，确保染色体准确分离和基因组稳定性。通过CRISPR-Cas9敲除CENP-E，研究人员观察到染色体错位、纺锤体组装检查点的激活以及随后的细胞周期停滞，导致非整倍性和基因组不稳定性。研究强调了CENP-E与关键动粒蛋白（如BubR1和KIF2C）的协同作用，并探讨了Aurora激酶在促进染色体聚合中的调控作用。研究结果突出了CENP-E在维持纺锤体组装检查点完整性中的关键作用，其抑制或缺失会导致基因组不稳定性，这既可能抑制肿瘤，也可能促进肿瘤发生。然而，进一步研究仍需探讨CENP-E与动粒蛋白相互作用的分子机制以及CENP-E敲除细胞系的存活途径。
此外，通过GSK923295抑制CENP-E导致其从动粒上解离并积累于纺锤体极，突显了其在维持纺锤体极完整性中的作用。无论是CENP-E的抑制还是敲除，均导致多极纺锤体的增加和中心体分散，表明CENP-E参与了双极纺锤体的形成。总体而言，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究人员展示了CENP-E在纺锤体微管组织和纺锤体极维护中的关键作用，有助于染色体的正确对齐和聚合，为细胞分裂机制提供了新的见解。
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