【文献解读】CRISPR筛选助力高阶遗传干扰研究的新突破
基因元素之间的相互作用对自然和人工表型至关重要，通常涉及复杂的编码和非编码序列组合。然而，在哺乳动物系统中，测试高阶遗传扰动面临限制。先前的CRISPR-Cas9筛选对每个细胞只能进行三种干扰，而Cas12a能够通过单个启动子生成多个CRISPR RNA，有望实现更大规模的干扰，但其DNase活性可能导致基因毒性。为了减轻这种影响，DNase失活的Cas融合蛋白（如dCas9的CRISPR干扰和CRISPR激活）已被广泛应用。利用DNase失活的Cas12a（dCas12a）进行多位点CRISPRi的研究平台将有助于组合基因功能的研究。尽管dCas12a在单个实验中展现了潜力，其在组合CRISPRi筛选中的效果尚不确定，需进一步研究。目前，dCas12a CRISPRi融合构建体在低剂量慢病毒递送时表现欠佳，限制了其在组合筛选中的应用。
为了解决这一问题，研究人员开发了一种带有R1226A突变的氨基酸球菌Cas12a（AsCas12a）变体。该突变增强了体外实验中核糖核蛋白-DNA复合物作为切口DNA中间体的稳定性。研究结果发表在《Nature Biotechnology》期刊上，题为Engineered CRISPR-Cas12a for Higher-Order Combinatorial Chromatin Perturbations。这一组合CRISPRi平台能够高效发现增强子元件，并探索顺式调控元件的高阶组合干扰，为有效导航染色质干扰的巨大组合空间奠定了框架。
一、通过慢病毒递送的dAsCas12a融合蛋白进行的CRISPRi缺乏活性
在这项研究中，研究人员开发了一个基于AsCas12a的CRISPRi功能基因组学平台。AsCas12a是目前唯一在哺乳动物细胞中的组合筛选中被证明有效的Cas12a同源物。先前的研究使用dAsCas12a通过质粒瞬时转染在HEK 293T细胞中进行CRISPRi。然而，当使用慢病毒递送的crRNA在K562细胞中测试该构建体时，未观察到基因表达的变化。通过一系列实验（如慢病毒转导），研究人员发现，与HEK 293T细胞中的质粒瞬时转染不同，使用dAsCas12a-3xKRAB和慢病毒crRNA构建体进行CRISPRi活性需要特定的条件才能达到最佳效果。为解决CRISPRi活性不足的问题，研究人员探索了Cas12a的多种优化突变，最终确定了denAsCas12a-KRAB为最有效的变体。该变体在CD55基因抑制上表现出强烈的效果，但在CD81基因上的结果却不一致。
研究还发现，提高denAsCas12a-KRAB的感染复数（MOI）可以改善CRISPRi的基因敲低效率。然而，在较低的MOI水平下，其活性下降甚至消失。为了解决这些不一致和缺陷，研究人员还探索了消除AsCas12a DNase活性的替代方法，例如使用截短的crRNA间隔区。然而，这些方法在不同细胞系中表现出较弱且不一致的CRISPRi活性。
图1 dAsCas12a-KRAB变体在慢病毒递送的crRNA中表现出弱且受剂量限制的CRISPRi活性
二、MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）显著改善了通过慢病毒递送的CRISPRi
为验证在dAsCas12a中完全激活DNA切割功能会通过降低DNA亲和力来阻碍强CRISPRi活性，研究人员进行了体外研究，发现当非靶链预切割时，dCas12a-DNA复合物的稳定性提高了20倍。R1226A突变以显著降低其切割活性而闻名。通过引入这一突变，研究人员发现该变体比完全失活的D908A变体更有效地结合DNA。研究结果表明，R1226A突变可以延长染色质占据时间，并通过KRAB结构域增强转录抑制复合物的招募。在将multiAsCas12a（多重转录干扰AsCas12a）变体与denAsCas12a-KRAB进行对比的实验中，发现multiAsCas12a在各种构建体中展现了稳定且强大的CRISPRi活性，并且对低蛋白质和crRNA水平的敏感性较低，且几乎没有脱靶效应。这一改进不仅恢复了几个先前无效的crRNA构建体的效力，还保持了靶位点上的低插入缺失（indel）频率，表明其在有效基因敲低的同时，尽量减少了对基因表达的潜在干扰。
图2 MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）通过促进切口DNA中间体，显著增强慢病毒递送的CRISPRi活性
三、MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA阵列慢病毒构建体实现多基因转录抑制
为评估multiAsCas12a-KRAB在CRISPRi中的活性，研究人员使用慢病毒crRNA阵列测试其在每个细胞靶向三个或更多基因位点的表现。结果表明，multiAsCas12a-KRAB在各种构建体中表现出显著优越的CRISPRi活性，且基因敲低强烈依赖于KRAB结构域。插入缺失（indel）分析显示，基因敲低主要是由于转录的非遗传扰动，而非DNA残余切割。在单细胞水平上，multiAsCas12a-KRAB优于denAsCas12a-KRAB，成功实现了多个靶点的敲低，尤其是在高阶构建体中，尽管某些构建体显示出活性下降。这些发现表明，multiAsCas12a-KRAB在多重CRISPRi应用中具有潜力，同时也强调了pre-crRNA序列背景对CRISPRi效率的不可预测影响。
图3 MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA慢病毒构建体实现多基因CRISPRi扰动
四、MultiAsCas12a-KRAB在组合单导向CRISPRi筛选中优于denAsCas12a-KRAB，并表现出与dCas9-KRAB类似的性能
研究人员设计了一个包含77,387个单一crRNA慢病毒构建体的文库，以根据细胞适应性评估Cas12a CRISPRi活性与转录起始位点（TSS）的关系。在表达multiAsCas12a-KRAB的K562细胞中进行的组合适应性筛选显示，细胞适应性评分的符合度高于denAsCas12a-KRAB，表明其性能更好且非特异性基因毒性较低。结果显示，multiAsCas12a-KRAB在TSS周围有效生成了CRISPRi活性的元基因谱，类似于dCas9-KRAB，并优于denAsCas12a-KRAB。尽管靶向非典型PAM的少数crRNAs表现出活性，但PAM序列内各个crRNA的活性差异显著，这些差异无法完全通过CRISPick模型预测。
图4 MultiAsCas12a-KRAB支持针对TSS的组合CRISPRi筛选，包含6重crRNA阵列
五、MultiAsCas12a-KRAB通过6重crRNA阵列实现组合CRISPRi筛选
为了评估multiAsCas12a-KRAB在组合CRISPRi筛选中的性能，研究人员构建了一个新的文库，并在表达multiAsCas12a-KRAB的K562细胞中进行了筛选。该变体表现出高度重复一致性且无显著的非特异性基因毒性。结果表明，测试位点间隔区的细胞适应性缺陷较单个crRNA弱，活性单crRNA的召回率为59%至90%，表明大多数单个活性crRNA在整合到6重阵列中时仍保持可测的活性。
图5 MultiAsCas12a-KRAB CRISPRi支持增强子扰动与发现
六、顺式调控元件的发现与高阶组合干扰
人类基因组估计包含约50万个增强子，但其中只有一小部分经过了功能测试。该研究证实，multiAsCas12a-KRAB可以通过CRISPRi扰动基因启动子及其增强子，特别是展示了其靶向HBG1/HBG2旁系基因和HS2增强子的能力。在K562细胞的CD55基因座中，研究人员鉴定出若干之前未表征的调控CD55表达的增强子，标志着在髓系细胞中首次功能验证的增强子。此外，他们利用multiAsCas12a-KRAB研究了MYC基因座上高阶扰动的影响，发现联合靶向多个顺式调控元件比单独靶向启动子产生更强的基因敲低效果。这些发现强调了multiAsCas12a-KRAB在增强子研究中的实用性，并表明组合靶向调控元件能够更有效地调控基因表达，从而为高效测试遗传扰动建立了框架。
图6 multiAsCas12a-KRAB对顺式调控元件的高阶组合靶向建立了群体测试框架
总体而言，CRISPR-Cas介导的染色质干扰研究发展迅速。通过灵活结合多种效应蛋白结构域，multiAsCas12a支持针对多个染色质干扰目标的群体测试。结合群体测试框架，multiAsCas12a能够在此前难以实现的规模上促进组合遗传过程的设计与理解，涵盖广泛的生物学领域。本研究确立了multiAsCas12a-KRAB作为高阶组合CRISPRi干扰的强大平台，展现了其在基因转录和增强子功能调控中的优越性，使其成为精确基因调控的可靠工具。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02224-0
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