【CRISPR/Cas9】gRNA切割效率低怎么办？
CRISPR/Cas9基因编辑技术自问世以来，已被广泛应用于如遗传疾病治疗、基因的筛选等许多领域，并具有巨大的应用前景。而其效率可能直接影响到推广应用，充分了解CRISPR/Cas9的活性规律，尽可能提升其切割效率，是将CRISPR/Cas9技术进一步推广应用的关键一环。而目前为止对其活性规律的理解仍然不完整。
近来，Giulia I. Corsi等在nature communication杂志上发表了题为《CRISPR/Cas9 gRNA activity depends on free energy changes and on the target PAM context》的文章。文中通过研究化脓性链球菌Cas9同源蛋白（以下简称Cas9），建立能量模型并进行分析、预测gRNA的效率、分析脱靶效应以及分析Cas9的局部滑动对gRNA效率的影响,从而进一步加深对于CRISPR/Cas9的活性规律的理解。
首先,作者创立了一个能量模型ΔGB=δPAM(ΔGH-ΔGU-ΔGO),ΔGH为gRNA和靶DNA的结合能、ΔGO为DNA双链的自由能、ΔGU为gRNA的折叠能，δPAM为PAM 序列类型的校正因子（图1）
图1
作者从23902个Cas9 gRNA样本中筛选掉低特异性和错误折叠的gRNA，得到11602个适合的gRNA样本。作者统计了这些样本的ΔGB、ΔGH、ΔGU、ΔGO(ΔGB数值低对切割效率更有利)，发现高效与低效gRNA的ΔGH差异最为明显。（图2）且高效gRNA的ΔGH的最适范围落在−64.53 and −47.09 kcal/mol之间。另外，作者通过统计观察到高效gRNA的3′端种子区域存在一定的碱基偏好（高GC频率）（图3），这种偏好使gRNA可以更稳定结合DNA。
图2
图3
作者引入了Lin[1]等人的研究，发现在一组GC含量最高的gRNA中，(GC=70%)在完全互补的靶点上的插入频率为30%，其效率不如该gRNA的其中6个缺失的脱靶样本(图4)。中等含量GC的gRNA（GC=50%）在靶的插入效率高于脱靶效率，在靶的ΔGH落在最适范围区间，脱靶的ΔGH落在最适范围之外（图5）。说明根据最适区间虽然不能完全准确预测gRNA效率，但存在一定关系；计算GC的百分比含量，可以对脱靶的预测提供有限的参考。
图4
图5
基于 Cas9 可以通过在 DNA 上滑动来搜索 PAM [2]，作者利用能量模型分析了Cas9局部滑行时重叠PAM位点的效率,发现与非重叠的PAM的插入频率相比，downstream PAM的平均插入频率降低；upstream PAM的平均插入频率提高 ；downstream PAM和upstream PAM整体的平均插入频率降低（图6）。
图6
作者还结合之前定义的CRISPRSpec得分[3]，对可能滑动的 gRNA 进行了评估，作者在两个独立的测试集上研究了添加局部滑动考虑因素前后CRISPRSpec和gRNA效率之间的关系。gRNA被分成三组大小相等的低、中和高CRISPRSpec或CRISPRspecExt。发现在引入局部滑动这一因素后，三组之间的CRISPRspecExt分离变得更加明显，并且三组在效率方面都呈现出更加显著的差异(图7)。经过进一步验证，作者发现CRISPRspecExt与gRNA效率之间呈正相关性。这些结果表明，局部和/或基因组脱靶的强烈结合竞争会削弱切割活性。
图7
作者还分析预测了在Cas9变体SpCas9-NG的效率[5]。发现在两种变体中，GHHH 之后的目标比 HHHH 之后的目标更有效地切割，与 SpCas9-NG 中的 HHHH 相比，下游滑动显示HHGH和HHHG中的任何一个在目标上的效率都提高了，而在xCas9中，只有HHGH比HHHH更有效（图8）。考虑到 xCas9 的特异性增加，这可以预期。这些结果表明，对于非经典PAM，周围的G会明显提高gRNA效率。
图8
研究结果1.gRNA的效率与其GC含量百分比具有一定的相关性，但ΔGH、ΔGU、ΔGO与GC百分比均有一个最适范围，且效率与插入频率相关。根据能量模型的最适范围可以较为准确的预测出高效率的gRNA。
2.Cas9局部滑行时，重叠PAM位点对gRNA效率有一定影响；不同类型的PAM上的局部滑行对Cas9效率也存在一定影响，而能量模型也能对这种现象做出解释。
3.建立能量模型，对于Cas9效率的预测存在一定的帮助，但对于Cas9的活性规律有待更深入的研究。
综上所述，该文章通过建立能量模型来研究Cas9的切割效率以及其活性规律，最终得出CRISPR/Cas9 gRNA的活性与GC含量百分比和PAM位点有关。
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