【直播回放】CRISPR文库筛选实验流程及应用问答集锦
10月26日14:00，艾迪基因高级研发科学家张旭博士开展了主题为[CRISPR文库筛选实验流程及应用]线上课程，反响热烈。在最后答疑阶段，老师们提出了许多困惑已久的问题，并且得到了满意的解答，接下来，让我们回顾一下本次直播的精彩问答吧！
精彩问答
Q:如何确定我订购文库的质粒量？
A:确定文库质粒量要根据文库大小、包病毒量和实验组来确定，一般来讲，订购文库的量都是不够的，要进行文库扩增后才够的，比如几百微克，甚至上毫克，全基因组文库可能要达到毫克级。
Q:慢病毒包装后感染实验细胞药筛后是否需要测序？
A:可以测，这是一个质控的过程，看一下有多少sgrna感染多少细胞，sgRNA representation有多少，但是如果前期sgRNA文库质量做的比较好，这一步还是比较有保证的。
Q:药筛后的细胞是否可以冻存？传代后是否容易丢失？要在几代内完成加压试验？
A:一般来说，构建基因突变细胞池的时候，起始量很大，大到筛选完之后基本上可以直接进行加压实验，从而不进行过多的扩增。因为不同基因的敲除对细胞的影响是不同的，细胞之间会存在竞争，均一性大大下降，sgRNA容易丢失，因此在进行加压实验时，传代次数越少越好。
Q:单载体和双载体各有什么优势？选择哪种系统更好？
A:推荐使用双载体系统。（1）双载体可以很好评估cas9稳转株的Cas酶切活性，用单载体则很难评估，因为每个细胞整合的Cas酶的位置可能不一样。（2）cas载体很大，单载体系统包毒的时候要困难很多，细胞使用量增加，工作量增加（3）单载体很不灵活，进行一个筛选需要一个单载体，而双载体只需要构建sgRNA文库病毒就可以了。
Q:MOI值很高的话，怎么转染？
A:无论高还是低，都尽量保持转染效率在30％左右，如果MOI值很高，只能通过提高感染病毒量来使得最终实现30％的感染效率，为什么感染效率要保持在30％呢，因为这个时候是一个相对平衡的状态，是感染病毒的使用量还有整合了单个sgRNA的细胞的占比最高的时候。
Q:Cas9稳转株需要做到单克隆吗？
A:理论上是要做到单克隆。但TAKARA做过一个对比实验，最终结果是用多克隆好一些。
Q:不同文库种类优劣分析？选择哪种类型的文库更好？
A:目前我们接触比较多的还是敲除文库，它比干扰文库、激活文库更稳定些，但现在有人优化过激活系统，可能效果也不错。具体哪一个文库更好还是要具体问题具体分析。
1. 艾迪基因提供一系列现货文库质粒、文库病毒，以及定制文库。双十一活动火热进行中，文库质粒免费送！点击查看活动详情>>>
2. 以上只是这次直播课的一小部分解答内容，更多精彩问答可观看直播回放，点击查看直播回放>>>
祝大家科研顺利！拿大项目！发大Paper！
18102225074（微信同号）
market@edgene.cn
相关资讯：
【干货分享】CRISPR/Cas系统原理及Cas9与Cas12a区别>>
利用CRISPR文库筛选技术，解码癌细胞触发γδT细胞检测新途径>>