T7 Transcription Kit说明书
【产品编号】
JT101-01
【产品说明】
本试剂盒进行了体外转录体系的优化，利用T7 RNA Polymerase，以含有T7启动子的超螺旋质粒DNA或线性DNA 为模板，对T7启动子下游的DNA序列进行高效转录。本产品适用于制备长度超过6000 nt的高浓度RNA，使用1μg DNA模板可在20μl体系生成150~280μg的RNA(如果想获得毫克级的RNA产物，可平行放大反应体系)。制备的RNA可用于体外翻译、RNase保护实验、RNA剪切以及杂交探针标记等。
【保存条件】
-20℃，保存一年
【试剂盒组成】
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Component |
JT101-01(25rxns) |
JT101-02(100 rxns) |
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T7 Transcription Enzyme Mix |
50μl |
200μl |
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5×T7Transcription Reaction Buffer |
100μl |
400μl |
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ATP(100mM) |
50μl |
200μl |
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GTP(100mM) |
50μl |
200μl |
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CTP(100mM) |
50μl |
200μl |
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UTP(100mM) |
50μl |
200μl |
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DNaseI(1 unit/ul) |
50μl |
200μl |
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500mM EDTA(pH 8.0) |
25μl |
100μl |
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RNase-free Water |
1ml |
5ml |
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Transcription Control Template(0.5μg/μl) |
10μl |
40μl |
【模板参考】
T7 Promoter：5'-TAATACGACTCACTATAGGG#-3'#:G/A
Terminator：5'TTCCATCTGTTTTCTTATCTGTTCTTTCATCTGTTCTTTTATCTGTTTGTTT 3'
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模板用量 |
RNA产量 |
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2μg |
170~320μg |
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1 μg |
150~280μg |
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500 ng |
100~180μg |
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200 ng |
40~80μg |
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100 ng |
15~40μg |
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50ng |
10~20μg |
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10ng |
4~8μg |
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lng |
2~6μg |
【操作流程】
1、除了T7 Enzyme Mix之外，将其余组分短暂离心并收集于管底。
2、配制转录反应：
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Component |
Volume |
终浓度 |
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Template |
1ng~2μg |
NA |
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5×T7 Transcription Reaction Buffer |
4μl |
1× |
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A/G/C/UTP |
1.6μl each |
8mM each |
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T7 Transcription Enzyme Mix |
2μl |
NA |
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RNase-free Water |
Variable |
NA |
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Total Volume |
20μl |
20μl |
*注意：提前计算好体系，然后严格按照以下顺序加入各反应组分：水→Buffer→NTP→DNA模板→酶。
3､移液枪轻轻混匀各组分并短暂离心收集于管底，37℃孵育2小时。
*注意：为避免长时间转录导致反应液挥发，建议在PCR仪中进行反应并将热盖温度设置为65℃。模板量及孵育时间可适当调整。
4､消化DNA模板：反应结束后,加入2μl DNase I，37℃反应30分钟；结束后加入1μl 500 mM EDTA(pH 8.0)终止反应(加入EDTA后应立即进行后续纯化)，或者消化完成后不加入EDTA,直接进入纯化步骤｡
5､产物纯化
6､转录产物定量､检测：
(1)通过紫外分光光度计测定RNA浓度，产物浓度极高,建议稀释后再测｡
(2)100~1000 nt的RNA产物推荐使用6%丙烯酰胺、7M尿素变性胶检测,电泳缓冲液为1×TBE Buffer｡
l 10×TBE Buffer：0.9 M Tris Base、0.9 M Boric Acid､20mM EDTA。
l 凝胶配制方法：每10ml中，尿素4.2g,RNase-free Water 4.4ml，40%(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=19:1)丙烯酰胺1.5ml，10×TBE Buffer 1ml,10%AP 100μl，TEMED 10μl。AP和TEMED在尿素完全溶解后加入。
(3)500~6000 nt的RNA产物推荐用1%甲醛琼脂糖变性胶检测,电泳缓冲液为1×MOPS Buffer｡
l 10×MOPS Buffer：0.4 M MOPS(pH 7.0)､0.1 M Sodium Acetate､10mM EDTA｡
l 凝胶配制方法：每100ml中,称量1g琼脂糖加入72ml RNase-free Water中，加热溶化后，加入10ml 10×MOPS Buffer。待溶液冷却至50~60℃时，加入18ml甲醛(37%)，混匀，倒胶。
(4)电泳检测时，取0.2~1 μg RNA，用RNase-free Water稀释至5μl，加入等体积的2×RNA Loading Buffer混匀，70℃孵育10分钟后冰浴2分钟，全部点样。电泳结束后用Gelstain或EB染色观察，RNA Marker与RNA样品处理方法相同(或参考供应商使用说明书)。
【数据参考】
图1 20μl体系下，长度小于300nt的RNA转录产量与模板投入量、转录时间的关系图