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RNA恒温快速扩增试剂盒（液体荧光型）使用说明书
【产品名称】
通用名称：RNA恒温快速扩增试剂盒（液体荧光型）
【包装规格】
货号：WLRE5003
规格：100T
【原理概述】
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。本试剂盒在42 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。
【引物设计】
建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。
【荧光探针设计】
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5’端的≥ 35 nt的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4 nt；THF距离3’末端≥15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。
【试剂盒组成】
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组成 |
含量 |
|
C buffer |
1 mL×2管 |
|
L buffer |
500 μL×1管 |
|
PR-core |
1.2 mL×1管 |
|
E-core |
60 μL×1管 |
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B buffer |
300 μL×1管 |
|
使用说明书 |
1份 |
【试剂盒储存】
1．运输温度：≤ 20 ºC的恒温环境；
2．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C的恒温环境，避光保存，避免重压、反复冻融；
3．产品有效期：6个月；
4．生产日期见外包装。
【操作步骤】
提前将试剂盒所需组分取出，冰上或低温下融化（C buffer可室温融化），震荡混匀。
(1) 向无菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
(2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针，
(3) 加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
(4) 加入12 μL PR-core和0.6 μL E-core（步骤1~4可以混合后再分装至反应管中）；
(5) 向反应管中加入3.8 μL核酸模板；
(6) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议提前将B buffer加至反应管的盖子内侧，盖上盖后上下颠倒后混匀）；
(7) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42 ºC；每30 s采集一次荧光信号；反应时间20 mins。
注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。
体系配制
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组分 |
体积（μL） |
|
C buffer |
20 |
|
L buffer |
5 |
|
PR-core |
12 |
|
E-core |
0.6 |
|
dNTPs(10 mM) |
1.5 |
|
下游引物(10 μM) |
2 |
|
下游引物(10 μM) |
2 |
|
探针(10 μM) |
0.6 |
|
核酸模板 |
3.8 |
|
B buffer |
2.5 |
|
总体积 |
50 |
【注意事项】
1. 由为保证液体试剂组分活性，请保证储存温度 ≤ -20 ºC；试剂使用时请保持低温，避免高温放置过长时间；
2. 在进行反应时请注意避免微量核酸染，并设置空白对照实验组。
