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      CRISPR文库筛选技术是一种高通量功能基因组学方法，通过设计大量向导RNA（gRNA）靶向不同基因，结合CRISPR-Cas9系统对细胞或生物体进行基因编辑，从而系统性研究基因功能。近年来，该技术被广泛应用于疾病机制解析、药物靶点发现等领域。

      2025年2月，《Nucleic Acids Research》在线发表了题为 "Optimizing gRNA selection for high-penetrance F0 CRISPR screening for interrogating disease gene function" 的研究论文。该研究由 Sheng-Jia Lin团队 完成，通过优化gRNA选择策略，开发了高表型穿透力的F0代CRISPR筛选方法，为快速验证人类疾病基因功能提供了高效、可靠的技术平台。

文章亮点

       ① 优化gRNA选择规则：使用CRISPOR平台综合多种算法评估gRNA的切割效率和编辑结果，优先选择 Lindel评分＞75 的gRNA。

       ② 高效的基因敲除：仅需1-2个gRNA即可实现>80%的表型渗透率，避免了传统方法中3-4个gRNA导致的胚胎畸形和高脱靶率。

       ③ 表型与分子的成功验证：斑马鱼F0代敲除与稳定敲除系（F2代）在形态表型和转录组学特征上高度一致。

       ① 高成本与低渗透率：传统方法需要3~4个gRNA且表型穿透率低（＜50%）。

       ② 脱靶与毒性：CRISPR/Cas9系统脱靶率可高达50%，且多个gRNA联用可能导致15-50%的畸形胚胎。

       为了解决这些问题，研究团队优化了gRNA选择策略，开发了高表型外显率的F0代CRISPR筛选方法。

1. gRNA选择策略优化

       研究团队靶向基因功能域N端区域设计gRNA，确保突变引发移码或无义介导的mRNA降解（NMD）。通过CRISPOR平台综合多种算法评估gRNA的切割效率和编辑结果，优先选用Lindel评分＞75的gRNA，提高了编辑效率，且畸形胚胎率低于5%。

图1 gRNA的选择策略示意图

2. 高效多重基因敲除

       研究团队在斑马鱼中使用优化的gRNA选择策略，在斑马鱼中同时靶向 noto、rx3、slc45a2 基因（每个基因1个gRNA），95%（40/42）胚胎同时出现三种表型（无脊索、无眼、色素缺失）。表明优化后的gRNA设计支持高效多重编辑。

图2 多重基因敲除表型

3. F0代与稳定品系的一致性验证

       研究人员通过表型分析、转录组测序及基因拯救实验，证明了F0代 CRISPR敲除可高效模拟稳定敲除品系（F2代）的表型和分子特征，为高通量功能基因组学研究提供了可靠且快速的替代方案。

图3 F0与稳定敲除品系（F2）的转录组学分析

4. 应用场景

① 神经发育障碍（NDD）基因筛选：

       研究人员敲除20个NDD相关基因产生每个基因的F0敲除，发现6个呈现出小头/小眼，3个出现出心脏水肿，1个体长缩短，与人类患者临床特征一致。

图4 NDD基因的功能分析

② 听力基因筛选：

       斑马鱼内耳与人类具有高度相似性。在敲除63个内耳相关基因的F0代中，52个（82.5%）出现耳石形态异常或毛细胞减少，19个基因敲除导致听力响应下降（如 cdh23、den、dspa）。

图5 通过F0方法筛选与听力和前庭功能相关的基因

5. 结论与展望

       这项研究通过优化gRNA设计（靶向功能域N端、Lindel评分>75），显著提升了F0代CRISPR筛选的表型穿透力和可靠性。多重敲除和转录组验证表明F0模型可替代耗时费力的稳定品系，为复杂遗传病机制的解析提供了高效工具。

原文链接：DOI:10.1093/nar/gkaf180

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