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基因敲入载体构建
基因定点敲入（KI，gene knock in）是指外源DNA片段插入到指定的基因组位置，使该片段行使相应的功能。可以赋予细胞或生物体新的功能或恢复缺陷基因的正常功能，可用于研究基因功能与调控机制、构建疾病模型或开展基因治疗。
服务详情
| 服务类型 | 荧光蛋白定点敲入载体/标签蛋白定点敲入载体/特定DNA片段敲入的载体 |
|---|---|
| 交付标准 | 1.质粒图谱2.质粒测序结果3.质粒扩增操作说明4.质粒（sgRNA-Cas9编辑质粒、Donor质粒） |
| 周期/价格 |
 在线咨询 |
艾迪基因创新研发的高效基因敲入技术，采用了升级的CRISPR/Cas9系统，通过积攒十几年的基因编辑经验，总结出最优gRNA和Donor载体设计策略，具有更高的阳性率和更广的敲入位点选择性。可根据客户需求提供基因敲入载体构建服务。
服务优势
敲入片段长
可实现长达5 kb的DNA片段插入
高效的sgRNA
优化升级的sgRNA设计算法，可得到高编辑效率的sgRNA
高活性的Cas9质粒
高效切割基因组双链，从而提高编辑效率
团队经验丰富
技术人员专业性高，经验丰富，可根据客户需求设计科学的敲入载体
服务类型
可根据客户需求，综合基因等情况，进行基因敲入载体的设计与构建。
| 荧光蛋白定点敲入载体 | EFGP、Luc、mCherry等 |
|---|---|
| 标签蛋白定点敲入载体 | Flag、HA、Myc、HiBiT等 |
| 特定DNA片段敲入目标基因组位置的载体 | / |
| 特定DNA片段敲入基因组安全位点的载体 | / |
质粒图谱
pCRISPR Donor质粒图谱
pSpCas9质粒图谱
Advantage and Characteristic
Optimazied Strategy
We have create a unique sgRNA Design Logic
Optimazied Strategy
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参考文献
在C57BL/6 J小鼠的Ins2启动子下游插入tdTomato
CRISPR/Cas9-mediated knockin of IRES-tdTomato at Ins2 locus reveals no RFP-positive cells in mouse islets
使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究者构建了一种转基因小鼠模型，使其在胰腺β细胞中表达特定的荧光蛋白。在C57BL/6 J小鼠中，将tdTomato外源基因插入到Ins2启动子的下游。研究者设计了针对CRISPR/Cas9系统的Ins2特异性单导RNA靶向外显子2，同时构建了供体载体。然后，将Cas9、单导RNA和供体载体在体外显微注射到小鼠受精卵中，并将这些受精卵植入假孕小鼠体内。通过杂合子交配获得纯合子，并通过基因型鉴定、体内成像和冰冻切片验证了敲入效果。获得了六只F0小鼠和稳定遗传的Ins2-IRES-tdTomato F1。基因组测序结果显示，与对照组相比，敲入组的Ins2外显子没有变化，只有tdTomato的碱基序列被添加，没有发生碱基突变。然而，在体内成像和冰冻切片中未观察到红色荧光蛋白（RFP）的表达，敲入基因tdTomato的蛋白表达为阴性。结果表明，tdTomato蛋白的表达和荧光强度较低，未达到检测阈值。在CRISPR/Cas9技术中，IRES连接的外源片段会影响前基因的转录水平，从而导致下游基因的低水平表达，并影响基因插入的效果。
FAQ
艾迪基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
如何选择合适的载体类型？
选择载体时，应考虑实验的目的和宿主细胞的类型。例如，质粒载体常用于细菌中基因的表达或扩增，病毒载体则更适合用于哺乳动物细胞中的基因转导。除此之外，载体的启动子、复制子以及抗生素选择标记也需要根据具体需求进行选择。
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