关于Prime editor如何识别pegRNA并与目标DNA相互作用的分子机制尚不清楚，限制了对Prime editing过程的理解和进一步的优化。为解决这个问题，研究人员在多种状态下测定了Prime editor的冷冻电镜(cryo-EM)结构，为理解这一创新的基因组工程系统提供了结构框架。 研究人员使用冷冻电镜技术（cryo-EM）对Prime editor复合体在不同状态下的结构进行了分析，包括预启动、启动、延伸和终止状态，成功获得了Prime editor复合体在多个状态下的高分辨率结构，揭示了其在引导逆转录过程中的动态变化；基于结构信息，研究人员设计了pegRNA变体和Prime editor变体，并对M-MLV RT进行截短和融合，成功开发了一种更小尺寸的Prime editor变体（PECO-Mini），它在保持编辑效率的同时，提高了AAV载体的滴度和Prime editing效率，活性测试结果显示工程化后的Prime editor变体在体外具有与原始Prime editor相当的活性。该研究揭示了Prime editor复合体在不同工作状态下的结构特征，为理解其分子机制提供了重要信息。

Prime editing是一种新型的基于CRISPR的基因组编辑技术，它不需要双链DNA断裂或外源性供体模板DNA，展现出在生物医学研究和基因治疗方面的巨大潜力。尽管Prime editing技术具有多功能性和精确性，但它在不同类型的编辑、目标位点和细胞类型中的效率存在很大差异。因此，为了实现更广泛的应用，需要提高Prime editing的效率。 研究人员筛选了11种不同来源的RT变体，使用GenScript算法优化其人类密码子，发现PE蛋白表达水平提高了1.4倍；通过删除RNase H结构域和进一步缩短RT序列，创建多个截短的PECO变体，使Prime editor在保持编辑效率的同时长度减少了621bp；为了实现有效的双AAV传递PE，研究人员构建了基于不同Cas9分裂位点和intein的分裂PE系统，确定了Rma 573-574和674-675分裂位点，这两个位点与Rma intein结合使用时，显著提高AAV载体的滴度和Prime editor效率。通过工程化改造和优化，研究人员成功提高了Prime editing技术的编辑效率，并且解决了AAV载体大小限制的问题，为未来的基因治疗和生物医学研究提供了一个更加有效和实用的工具。

该文章解析了prime editing技术中pegRNA引导逆转录的结构基础。研究通过高分辨率的结构分析，揭示了Prime Editor中的关键蛋白质，包括Cas9和逆转录酶的三维构象及其与pegRNA的相互作用。详细描述了pegRNA如何引导Prime Editor识别特定DNA序列并进行逆转录，将预定的基因序列插入目标位置。此外，研究还讨论了关键氨基酸残基在pegRNA结合和逆转录过程中的作用，解析了这些分子互动的精确机制。这一发现不仅深化了我们对Prime Editing机制的理解，还为优化和改进该技术提供了宝贵的结构信息，推动其在基因治疗等领域的应用。

镰状细胞病（Sickle-cell disease, SCD）是一种由β-珠蛋白基因（HBB）中的一个A·T到T·A的点突变引起的常染色体隐性遗传病。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的唯一治愈SCD的方法是同种异体造血干细胞移植。然而，大多数患者缺乏理想的供体，并且该手术会导致严重的毒性。通过校正患者自身的造血干细胞（HSCs），可以绕过免疫并发症，并消除对组织相容性供体的需求。目前，已有一些关于使用Cas9核酸酶启动的同源定向修复（HDR）和腺相关病毒类型6（AAV6）递送的DNA模板来校正SCD突变的临床试验研究正在进行中。 在该文章中，研究员们利用优化的prime editing系统对SCD患者造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行体外校正，通过电穿孔将PEmax mRNA与合成的epegRNA和切割sgRNA结合使用，成功将SCD等位基因（HBBS）校正回野生型（HBBA），校正频率在15%到41%之间。之后，研究员们将经过启动编辑的HSPCs移植到免疫缺陷的小鼠体内，7周后，编辑的HSPCs在小鼠骨髓中维持了HBBA水平，并显示出与未编辑的健康供体HSPCs相似的植入频率、造血分化和谱系成熟。治疗效果评估发现，在移植后的小鼠中，平均42%的人红细胞前体和网织红细胞表达了HBBA，超过了预测的治疗益处水平。基因特异性分析也表明启动编辑系统具有高度的目标DNA特异性。最终研究结果证实了该技术手段的安全性和效率，具有长期效果和多克隆性。总结来说，这项研究展示了prime editing技术在治疗SCD中的潜力，证明了其在提高治疗效果和降低非目标编辑风险方面的有效性。