​

        快速而准确地检测核酸生物标志物对于诊断和监测传染病至关重要。传统的检测方法，如qPCR和测序，虽然有效，但受限于其复杂性、成本和时间要求。同时，尽管等温核酸扩增简化了检测过程，但常常会导致非特异性扩增和假阳性结果。基于CRISPR的诊断方法（Crispr-Dx）利用Cas12或Cas13，通过切割单链DNA或RNA来检测病毒、基因突变等多种靶标。然而，Crispr-Dx检测中的信号生成严重依赖于单链核酸的反式切割，这限制了其在复杂生物环境中的信号效率、灵敏度和稳定性。

       为了解决这一问题，研究人员开发了CrisprAIE系统。这一创新系统将CRISPR/Cas反应与多合一聚集诱导发光材料（AIEgens）相结合，通过Cas蛋白反式切割与AIEgen结合的双链DNA来增强荧光。该研究成果发表在《Nature Communications》上，题为CRISPR/Cas-mediated 'one to more' lighting-up nucleic acid detection using aggregation-induced emission luminogens。CrisprAIE在临床检测诺如病毒和SARS-CoV-2时表现出卓越的性能，无需依赖扩增方法。其诊断能力通过引入球形核酸修饰的AIEgens和便携式手机读取设备得到进一步提升。这一组合使其相比传统的CRISPR诊断方法，显著提高了灵敏度。总的来说，CrisprAIE被定位为一种多功能信号生成策略，能够大大提升现有CRISPR诊断技术的检测效率。

一、CRISPR驱动的AIEgen荧光信号输出

       阳离子型AIEgens通过静电相互作用与DNA链结合，激活了分子内运动的限制（RIM），从而产生增强的荧光信号。是一种典型的阳离子AIEgen，具有四个带正电的吡啶基团，可用于无标记检测双链DNA和单核苷酸多态性。与传统荧光团如FAM相比，它具有较大的斯托克斯位移和更强的抗光漂白能力。由于Cas核酸酶更偏好单链寡核苷酸，研究人员设计了ssDNA和dsDNA修饰的AIEgen探针。基于dsDNA的探针通过更有效地限制AIEgen运动，产生了更强的荧光信号，与传统方法相比，LOD降低了约80倍。这一改进归因于在dsDNA中更有效的AIEgen限制、高效的信号放大以及更高的信噪比。不仅如此，CrisprAIE在低温条件下表现出极佳的稳定性，与冻干CRISPR试剂兼容，并且可以与其他AIEgens适配。这些特点使CrisprAIE成为复杂生物系统中高灵敏度核酸检测的有前景工具。

图1 CrisprAIE检测方法示意图

图2 CRISPR驱动的AIEgen荧光信号输出系统构建

二、结合RT-RPA的CrisprAIE RNA定量检测

       CrisprAIE系统结合RT-RPA（逆转录重组酶聚合酶扩增）被开发用于高度灵敏和特异的RNA检测。它将Q-dsDNA/AIEgen-Q荧光报告与Cas12介导的检测相结合，集成了逆转录和扩增过程，实现了一管式等温RNA检测。在诺如病毒检测中，CrisprAIE系统准确识别了临床呕吐样本中的病毒RNA，结果与RT-qPCR一致，证实了其高效性和可靠性。此外，该系统的多功能性在SARS-CoV-2 RNA的定量检测中得到了进一步展示，CrisprAIE方法的AUC达到了0.969，显示其作为临床诊断中RNA定量检测工具的巨大潜力。

图3 RT-RPA与CrisprAIE结合可检测到极低浓度（10^18摩尔级）的诺如病毒RNA

图4 RT-RPA与CrisprAIE结合可检测到单拷贝水平的SARS-CoV-2 RNA

三、使用AIEgen辅助SNA报告探针提升CrisprAI的灵敏度和稳定性

       传统的线性DNA报告探针虽有效，但在生物液体中容易受到核酸酶降解，从而导致假阳性结果。相比之下，SNA/AIEgen报告探针结合了纳米颗粒和核酸探针，提供了更强的稳定性、增强的荧光猝灭效果以及更高的抗核酸酶能力。开发的SNA/AIEgen报告探针的检测限（LOD）低至55.7 fM，显著优于传统的Q-dsDNA/AIEgen-Q和Q-ssDNA-FAM探针。即使在复杂的生物样本（如血清）中，它也能保持稳定性和准确性。此外，它能够有效检测多种临床相关的目标，如诺如病毒、SARS-CoV-2和HPV，且基质干扰最小，展示了其在现场诊断中的强大性能。结合RT-RPA后，SNA@AIEgen探针进一步将SARS-CoV-2的检测灵敏度提高到0.1拷贝/µL，相较于之前的方法提高了十倍。该系统在多个批次中表现出良好的重现性和一致性，突显了其在实际病毒诊断中的可靠性。

图5 AIEgen辅助SNA报告探针增强了CrisprAIE在复杂样本中对目标DNA的检测能力

图6 扩展CrisprAIE以实现复杂样本中目标RNA的直接检测

四、扩展CrisprAIE以实现目标RNA的直接检测

       CrisprAIE系统通过使用Cas13a扩展，实现了对RNA目标的直接检测。与Cas12a需要将RNA逆转录为DNA不同，Cas13a可以直接识别RNA。基于Cas13a的CrisprAIE系统使用了在Q-dsDNA/AIEgen-Q和SNA/AIEgen报告探针中的ssRNA连接子，通过Cas13a对ssRNA的反式切割，实现了有效的RNA检测。根据使用的报告探针，CrisprAIE系统相比传统的Q-ssRNA-FAM探针提高了10到100倍的灵敏度。它成功检测了合成的RNA目标，包括诺如病毒、SARS-CoV-2和埃博拉病毒，即使在复杂的生物样本如呕吐物、咽拭子、唾液和血清中也表现出出色的检测能力。SNA/AIEgen报告探针显示出优异的抗基质干扰能力，展现了其在现场RNA目标诊断中的鲁棒性和潜力。

图7 适用于现场检测的CrisprAIE便携设备

五、CrisprAIE在POC检测中的应用

       与传统Crispr-Dx相比，CrisprAIE技术显著提高了检测灵敏度，同时保持了简便的检测过程，使其非常适合即时检测（POC）应用。研究人员开发了一种便携的手机CrisprAIE检测平台，配备了3D打印的机身、LED照明灯和电路装置，用于捕捉荧光图像。检测过程包括将样本加入含有RPA和CrisprAIE试剂的试管中，孵育30分钟，然后通过手机显示结果。该手机CrisprAIE检测平台的分析性能与商业Multiskan GO多模式读数仪相当，在合成RNA目标检测中具有相似的灵敏度和动态范围。相关性分析进一步证实了该检测平台在POC诊断中的可靠性。

图8 CrisprAIE与已有Crispr-Dx方法在有扩增和无扩增情况下的比较

       新兴传染病如的出现突显了快速可靠的现场诊断技术的迫切需求。这项工作引入了首个AIEgen增强的Crispr-Dx检测，用于灵敏准确的核酸检测，无需扩增的情况下，它可以检测到飞摩尔级别的DNA和RNA，通过等温扩增可达到阿摩尔级别的灵敏度，展现了在传染病诊断中的巨大潜力。尽管AIEgen探针提供了高信噪比和优异的抗光漂白性能等优势，但其也存在一些局限性，如复杂样本的干扰以及核酸提取的必要性。未来对CrisprAIE的改进可以利用Cas核酸酶进化、crRNA结构优化和扩增引物筛选等方面的进展。此外，改进信号报告系统，如高量子产率AIEgen和数字读取设备，也可以进一步提升其性能。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-52931-0

艾迪基因拥有自主研发蛋白质表达纯化平台，经活性测试本公司的Cas酶产品活性明显优于市面上其他的酶，真正实现高纯度、高活性、高灵敏度酶产品的制备。更有恒温快速扩增试剂盒、CRISPR检测试剂盒现货，设备要求低，反应时间短，下单即达！

近期资讯

1.【一周时讯】新算法模型gRNA设计：驱动CRISPR检测灵敏度升级！
2.【文献解读】CRISPR筛选揭示神经干细胞的衰老关键调控因子
3.【一周时讯】抵抗衰老！CRISPR/Cas9筛选揭示葡萄糖代谢基因对抗细胞衰老新方式

联系我们

18102225074（微信同号）

market@edgene.cn