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【一周时讯】全基因组CRISPR筛选：揭示新宿主因子，优化轮状病毒疫苗生产
CRISPR/Cas系统是现代生物科学领域的一项革命性技术，其应用已经扩展到医学、农业、生态保护等多个领域，相关成果和应用实例不断涌现。CRISPR那些事儿设置一周时讯栏目，为您带来关于CRISPR的最新研究和行业新闻，以下是过去一周时讯的简单总结：
一、研究资讯
（一）CRISPR 筛选
1、文章题目：CRISPR/Cas9 screens identify key host factors that enhance rotavirus reverse genetics efficacy and vaccine production
期刊：npj Vaccines（IF：6.9）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41541-024-01007-7
轮状病毒对幼儿构成重大威胁。为了确定新的亲轮状病毒和抗轮状病毒宿主因子，研究人员使用恒河猴轮状病毒和非洲绿猴肾细胞进行了全基因组 CRISPR/Cas9 筛选。在 MA104 细胞中，SERPINB1或TMEM236（前两个抗病毒因子）的基因缺失以轮状病毒株独立的方式增加了病毒滴度，于是研究人员通过将 SERPINB1 敲除的 MA104 细胞与 C3P3-G3 辅助质粒相结合，优化了现有的轮状病毒反向遗传学系统，提高了恢复效率，并挽救了几种低滴度轮状病毒报告基因和突变株。此外，研究证明 Vero 细胞中的 TMEM236 敲除支持两种减毒活轮状病毒疫苗株的产量高于亲本细胞系，并且代表了更强大的疫苗生产细胞基质。这项研究开发了第三代优化的轮状病毒反向遗传学系统，并生成了基因编辑的 Vero 细胞作为改善轮状病毒疫苗生产的新底物。
2、文章题目：Large DNA deletions occur during DNA repair at 20-fold lower frequency for base editors and prime editors than for Cas9 nucleases
期刊：Nature Biomedical Engineering（IF：26.8）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-024-01277-5
当用于编辑基因组时，Cas9 核酸酶会在 DNA 中产生靶向双链断裂。研究人员报告称，DNA 修复过程中发生大量 DNA 缺失（> 100 bp）的频率比 Cas9 核酸酶低得多。研究小组使用 CRISPR 干扰筛选和高级测序分析了癌细胞系、干细胞和 T 细胞中 CRISPR 诱导的 DNA 缺失。Cas9 双链断裂在大多数细胞系中引起大量缺失（频率范围为 0.2-17.5%），在 T 细胞中的比例更高（~15%）。使用 DNA 修复途径小分子抑制剂的进一步实验表明，缺失主要由末端切除和 DNA 聚合酶 θ 介导的末端连接途径引起。虽然碱基编辑器和主要编辑器也产生大量缺失，但其频率比 CRISPR-Cas9 低 20 倍。研究人员强调了验证当前基因编辑工具在临床应用上的重要性，并提出了他们的工作流程作为一种策略来评估这些基因编辑器应用过程中产生的意外的 DNA 大或小变化。
（二）CRISPR基因敲除细胞
1、文章题目：Nuclear porcupine mediates XRCC6/Ku70 S-palmitoylation in the DNA damage response
期刊：Exp Hematol Oncol.（IF: 9.4）
原文链接：https://doi.org/10.1186/s40164-024-00572-w
DNA 损伤反应 (DDR) 的激活在很大程度上依赖于蛋白质的翻译后修饰 (PTM)，而蛋白质的翻译后修饰在预防遗传不稳定性和肿瘤发生方面起着至关重要的作用。在这些 PTM 中，棕榈酰化是一个高度保守的过程，在许多癌症类型中都失调。然而，它与 DDR 的直接关系及其潜在机制仍不清楚。研究人员利用CRISPR/Cas9技术生成PORCN KO和PORCN NLS KO细胞系。通过菌落形成试验、MTT试验、DR/EJ5同源重组/非同源末端连接报告系统、异种移植肿瘤生长和免疫荧光验证PORCN NLS在DDR中的作用。通过质谱法、酰基-生物素交换（ABE）棕榈酰化试验、Click-iT试验、细胞亚细胞分级试验、Western印迹分析以及体内和体外共免疫沉淀探索机制。
在本研究中，引入了证据表明豪猪 (PORCN) 是 DDR 的一个组成部分，并在其中发挥着关键作用。PORCN 缺乏会阻碍非同源末端连接 (NHEJ)，并使细胞对体外和体内的电离辐射 (IR) 高度敏感。此外，研究表明，PORCN 拥有一个具有 S-酰基转移酶活性的核部分 (nPORCN)，这与内质网中的膜结合 O-酰基转移酶不同， nPORCN 是成功激活 NHEJ 的必要条件。使用质谱法，我们揭示了 nPORCN 复合物的存在，并表明 nPORCN 介导 XRCC6/Ku70 在五个特定半胱氨酸位点对 IR 的响应进行 S-棕榈酰化。这些位点的突变会导致放射敏感性大幅增加并延迟 NHEJ。研究结果强调了 nPORCN 依赖性 Ku70 S-棕榈酰化在 DDR 中的重要作用。
（三）CRISPR检测
1、文章题目：Highly Sensitive One-Pot Isothermal Assay Combining Rolling Circle Amplification and CRISPR/Cas12a for Aflatoxin B1 Detection
期刊：Analytical Chemistry（IF：6.7）
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03798
谷物中霉菌毒素在世界各地广泛存在。然而，由于缺乏高效、超灵敏的检测方法，在实际样品中鉴定这些物质的难度很大。研究人员开发了一种新型一锅式等温测定法，该测定法整合了滚环扩增 (RCA) 和 CRISPR/Cas12a，用于检测黄曲霉毒素 B 1 (AFB 1 )。将 AFB 1添加到用 AFB 1适体和其互补 DNA (cDNA)双链功能化的磁珠后，适体对 AFB 1的特异性识别会导致 cDNA 释放从而激活 RCA 反应。随后，RCA 扩增子启动核酸内切酶 Cas12a 的反式切割和顺式切割活性。 RCA 与 CRISPR/Cas12a 的协同作用使 cDNA 呈指数级扩增，进一步促进 CRISPR/Cas12a 非特异性切割单链 DNA 报告基因，增强检测信号。值得注意的是，CRISPR/Cas12a 辅助的一锅式恒温检测不仅可以通过荧光检测实现超灵敏的定量检测，还可以通过横向流动试纸实现可视化检测，从而提高了资源有限地区霉菌毒素检测的可及性。检测限分别为 0.016 和 0.408 ng/mL。所提出的检测方法成功应用于实际样品，回收率令人满意，为 90% 至 114%。本研究提出了一种强大而通用的方法，可在各种应用中可靠且超灵敏地检测霉菌毒素。
（四）其他CRISPR相关研究
1、文章题目：An NLR family member X1 mutation (p.Arg707Cys) suppresses hepatitis B virus infection in hepatocytes and favors the interaction of retinoic acid-inducible gene 1 with mitochondrial antiviral signaling protein
期刊：Archives of Virology（IF：2.5）
原文链接：https://doi.org/10.1007/s00705-024-06133-0
NLR家族成员X1（NLRX1）是NOD样受体（NLR）家族的重要成员，在免疫系统调节中发挥着独特的作用。乙肝病毒（HBV）感染患者比健康人更容易发生NLRX1突变p.Arg707Cys。有报道称NLRX1可增加表达钠牛磺胆酸盐转运多肽（NTCP）的HepG2细胞中HBV的感染率。然而，NLRX1突变（p.Arg707Cys）在肝炎中的作用仍不清楚。研究人员利用LV003慢病毒构建了稳定过表达NTCP的Huh7细胞。研究结果表明NLRX1是抑制肝细胞抗HBV能力的调控因子，NLRX1的p.Arg707Cys突变可抑制HBV感染并激活IFN /核因子κB通路。通过调节NLRX1与RIG-I/MAVS的相互作用，有可能开发出更有效的抗乙肝病毒治疗方法。这项工作为未来探索其他病毒的免疫治疗也提供了宝贵的思路。
2、文章题目：PTPN20 promotes metastasis through activating NF-κB signaling in triple-negative breast cancer
期刊：Breast Cancer Research（IF: 6.1）
原文链接：https://doi.org/10.1186/s13058-024-01910-w
癌症转移仍然是三阴性乳腺癌（TNBC）临床治疗的主要挑战。NF-κB信号通路被认为是转移发展的关键因素，但其潜在的分子机制仍不清楚。研究人员使用瑞典乳腺癌癌症组分析网络和癌症基因组图谱数据库的数据，通过伤口愈合和 transwell 基质渗透试验检查 TNBC 细胞系中 PTPN20 过表达和通过shRNA 敲低的影响。此外，研究还分析了 4T1 异种移植肿瘤在裸鼠中的生长和转移能力。
研究结果发现，与对照组相比，TNBC 细胞系和患者样本中的 PTPN20 水平升高，且较高的蛋白质水平与无转移生存期相关。PTPN20 的过表达增强了体外迁移和侵袭能力，并促进了体内肺转移。PTPN20 通过在 Ser468 位点对 p65 进行去磷酸化来激活 NF-κB 信号传导，阻止其与 COMMD1 结合，从而保护 p65 免于降解。PTPN20 的下调有效抑制了 TNBC 细胞的迁移和侵袭能力，而 p65 S468A 突变体则恢复了 TNBC 细胞的迁移和侵袭能力。结果表明 PTPN20 通过激活 NF-κB 信号在 TNBC 转移中发挥关键作用，PTPN20 可作为 TNBC 治疗的新型预后标志物和潜在治疗靶点。
二、行业新闻
1、Iovance Therapeutics公司正在赞助一项首次人体试验IOV-GM1-201 ，以研究 PD-1 灭活肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 细胞疗法 (IOV-4001) 对先前治疗过的晚期黑色素瘤和非小细胞肺癌的作用，该试验目前处于多中心 2 期疗效阶段，试图为难治性癌症患者提供新的治疗选择。财务报告也显示该公司在研发方面的投入，未来如果该疗法成功，将可能改变这些癌症的治疗格局。
2、Vertex Pharmaceuticals 发布了与 CRISPR Therapeutics 共同开发的基因疗法 CASGEVY（也称为 exa-cel）的最新进展。CASGEVY已经在已在美国、英国、欧盟、沙特阿拉伯王国 (KSA)、巴林王国 (Bahrain)、加拿大和瑞士等多个国家和地区获得了批准，并正式进入市场，治疗镰状细胞病和输血依赖性β地中海贫血。作为一种创新的治愈性治疗方法，CASGEVY的上市为患者提供了新的治疗选择，标志着基因编辑技术在血液病治疗中的重要进展。
艾迪基因专注于CRISPR技术，提供一系列高质量的基因编辑服务和体外诊断产品：CRISPR文库筛选、细胞基因编辑、单克隆筛选、CRISPR检测。致力于为CRISPR相关、基因功能研究相关、体外诊断以及治疗相关的科学研究提供最高效的技术服务。
近期资讯
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