CRISPR-Cas12a新策略：利用变体减少空间位阻以增强反式切割活性

【文献解读】CRISPR-Cas12a反式切割活性增强新策略：利用变体减少顺式切割产物的空间位阻

CRISPR-Cas12a由于具有高效的反式切割（trans-cleavage）DNA酶活性而被广泛应用于分子诊断领域。尽管Cas12a的反式切割活性可以实现诊断应用中的信号放大，但其灵敏度在没有前扩增步骤的情况下仍然不足以用于临床。因此，需要进一步增强Cas12a的反式割活性以提高CRISPR-Cas12a基础诊断的检测限。已有研究证实顺式切割（cis-cleavage）产物产生的单链末端可能会与催化位点竞争性结合，从而在空间上阻碍报告DNA的结合及其反式切割。据此，来自韩国的一组研究人员提出了一种策略，即通过减少顺式切割产物对催化位点的立体阻碍来增强Cas12a的反式切割活性。相关研究成果近期发表在《Biosensors and Bioelectronics》杂志上，题为“Enhanced trans-cleavage activity using CRISPR-Cas12a variant designed to reduce steric inhibition by cis-cleavage products。”

一、破坏顺式切割产物对催化位点的空间位阻可以提高反式切割活性

先前的研究报告指出，预先移除双链切割末端显著提高了Cas12a的反式切割效率。该研究在荧光反式切割实验中也得出了类似的结果。在实验中，研究人员使用了具有不同大小靶标链（TS）突出末端的DNA激活剂来测量反式切割活性，并使用零级反应模型拟合时间轨迹，以获得不同DNA激活剂的表观反式切割速率（kobs）。结果显示，对于19 nt TS激活剂，其表观反式切割速率是全长TS激活剂的3.69倍，表明移除TS突出末端可以显著提高Cas12a的反式切割活性。

为了进一步探究TS突出末端是否立体阻碍了反式切割反应中DNA底物（trans-DNA）的装载，研究人员检查了W355A Cas12a的反式切割活性以及预先移除TS突出末端对W355A Cas12a反式切割活性的影响。W355A突变体利用更快的DNA解旋和随后的TS装载导致TS切割加速。结果显示，W355A突变导致反式切割活性显著降低，这与假设一致，即TS突出末端增加了与W355A Cas12a催化位点的结合，从而立体阻碍了反式切割DNA底物的结合。

图1 顺式切割产物的空间位阻对Cas12a反式切割活性的破坏作用

二、通过设计Cas12突变体破坏TS突出末端部分与催化位点的结合来增加反式切割活性

研究表明，Cas12a中的靶链装载（TSL）域负责引导并稳定靶标DNA链到其催化位点，并在顺式切割中保留TS。基于这一机制，研究人员们提出了一种策略，即通过突变Cas12a蛋白中的TSL域，减少TS突出末端与催化位点的结合，从而增加反式切割活性。他们在TSL域中引入了丙氨酸突变，这涉及将几个表面暴露的亲水残基（包括赖氨酸）替换为疏水的丙氨酸残基。为了测试这一策略是否可行，研究人员对多种Cas12a突变体进行了荧光反式切割实验，发现这些突变显著增加了反式切割活性，特别是KE1096AA突变体显示出最高的反式切割活性增加（5.8倍）。此外，研究人员还测试了其他四个在位点1096和1097具有疏水残基的Cas12a突变体（KE1096II, KE1096LL, KE1096VV, KE1096FF），发现这些突变体的反式切割活性与KE1096AA突变体相似。这些结果综合证实了，通过在TSL域引入疏水残基制备Cas12a变体，可以显著增加Cas12a的反式切割活性，同时保持其顺式切割活性。

图2 设计具有增强反式切割活性的工程化 Cas12a 突变体

三、低离子强度条件下Cas12a 反式切割活性显著增强

由于核酸的多电解质特性，反应缓冲液中的离子强度可以显著影响许多酶的体外活性特别是单价离子（如Na+和Cl-）的浓度可以极大地影响蛋白质域与单链DNA底物之间的分子间相互作用。为了进一步增强改进的Cas12a变体的反式切割活性，研究人员尝试优化离子条件来提升反式切割反应的效率。他们开发了一种称为盐稀释方法的新策略，即在高盐浓度下进行顺切割反应后，通过稀释盐浓度来提高反式切割活性，同时保持顺切割活性。在使用盐稀释方法的滴定实验中，随着NaCl浓度的降低，KE1096AA突变体和野生型Cas12a的反式切割活性都相应增加。在低盐条件下，KE1096AA突变体的反式切割活性提高了7倍以上。此外，研究人员还观察到在不同的单价离子（包括KCl、LiCl和RbCl）盐下类似的反式切割活性影响。利用这种盐稀释方法，研究人员成功实现了Cas12a的活性增强，显著提高了检测系统的灵敏度。

图3 盐稀释法可增强 Cas12a 的反式切割活性

四、使用改进的 Cas12a 突变体和盐稀释法检测乙型肝炎病毒

利用改进的Cas12a突变体（特别是KE1096AA突变体）和盐稀释方法，研究人员以HBV为检测对象进一步评估了他们开发的CRISPR/Cas12a系统的灵敏度。他们通过测试一系列稀释的含有HBV聚合酶序列的DNA质粒，并结合环介导等温扩增（LAMP）检测方法来进行评估。结果显示，使用KE1096AA Cas12a突变体和盐稀释方法的检测系统能够在阿摩尔（atto-molar）浓度水平上检测到DNA靶标，与常规的Cas12a基础检测系统相比，灵敏度得到了显著提高。研究人员还评估了在没有DNA扩增过程的情况下，HBV检测系统的灵敏度，并将其与常规Cas12a基础方法进行了比较。结果表明，即使在没有DNA扩增的情况下，改进的Cas12a基础检测系统也在灵敏度上有了显著提高。

此外，研究人员还测试了改进的Cas12a基础检测系统的特异性。他们使用非特异性DNA激活剂和含有人类基因组DNA的混合物来测试特异性，并与常规Cas12a基础方法进行了比较。测试结果一致表明，引入的丙氨酸突变和盐稀释过程不太可能影响系统的靶向特异性。这些结果证明了所提出的Cas12a基础检测系统在实际应用中的潜力，尤其是在快速准确检测病原体核酸方面。

图4 改进的基于 Cas12a 的检测方法性能评估

总的来说，这项研究通过在Cas12a的TSL域引入丙氨酸突变，成功开发了增强反式切割活性的Cas12a变体以及通过新的盐稀释方法在低离子强度条件下进一步增强了Cas12a的反式切割活性，显著提高了分子诊断的灵敏。据此建立的检测方法在乙型肝炎病毒（HBV）DNA诊断方面表现出高灵敏度和特异性，展示了其在临床应用中的潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116859

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