CRISPR筛选：揭示TMEM106B可介导SARS-CoV-2的ACE2独立感染途径

【一周时讯】CRISPR筛选：揭示TMEM106B可介导SARS-CoV-2的ACE2独立感染途径

CRISPR/Cas系统是现代生物科学领域的一项革命性技术，其应用已经扩展到医学、农业、生态保护等多个领域，相关成果和应用实例不断涌现。CRISPR那些事儿设置一周时讯栏目，为您带来关于CRISPR的最新研究和行业新闻，以下是过去一周时讯的简单总结：

一、研究资讯

（一）CRISPR 筛选

1、文章题目：BES-Designer: A Web Tool to Design Guide RNAs for Base Editing to Simplify Library

期刊：Interdisciplinary Sciences-Computational LIfe Sciences（IF：3.9）

原文链接：https://doi.org/10.1007/s12539-024-00663-6

CRISPR/Cas 碱基编辑器可精确转换单核苷酸而不会引起双链断裂。该技术在基因治疗、基因功能分析和其他领域得到了广泛的应用。尽管存在各种 gRNA 设计工具，但创建具有多种原型间隔区相邻基序（PAM）序列的简化碱基编辑库以进行 gRNA 筛选仍然是一个挑战。因此研究人员提供了一个新型网络工具 BES-Designer，用于基于碱基编辑器的 gRNA 设计，旨在简化碱基编辑库的创建。BES-Designer 结合了目标序列简化规则，帮助研究者缩小实验室生物实验的范围，它通过简化针对不同 PAM 和编辑类型的目标序列选择，促进 CRISPR-Cas 碱基编辑的向导 RNA (gRNA) 设计。该工具经过实验证明，可以在碱基编辑库上实现30%的效率提升。

2、文章题目：TMEM106B-mediated SARS-CoV-2 infection allows for robust ACE2-independent infection in vitro but not in vivo

期刊：Cell Rep.（IF：7.5）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114921

SARS-CoV-2主要通过细胞表面的ACE2受体进入宿主细胞。然而，最近的研究表明，一些细胞在没有ACE2的情况下也可以感染SARS-CoV-2，这提示存在可能的ACE2独立感染机制。研究人员使用携带刺突E484D的SARS-CoV-2小鼠适应性1（SARS-CoV-2 MA1）进行全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选，以确定ACE2独立的进入机制。TMEM106B（transmembrane protein 106B）是一个跨膜蛋白，之前已被发现与一些神经退行性疾病相关，研究人员假设它可能在ACE2缺乏的情况下帮助SARS-CoV-2感染。研究团队使用了体外细胞模型和小鼠模型进行实验。

在体外实验中，他们通过编辑细胞，使之表达TMEM106B，但不表达ACE2，来观察SARS-CoV-2的感染能力。研究发现，TMEM106B确实能够介导SARS-CoV-2的感染，即使在没有ACE2的情况下。实验表明，表达TMEM106B的细胞对SARS-CoV-2敏感，病毒能够顺利进入这些细胞并复制。然而，在小鼠模型中，这种ACE2独立的感染机制并不显著。该研究提供了SARS-CoV-2感染的另一种潜在通路，但也强调了体外和体内实验结果的差异。ACE2仍然是SARS-CoV-2感染的主要途径，而TMEM106B的发现则为科学家提供了新的研究方向。

（二）CRISPR基因敲除细胞

1、文章题目：Expanding the cell quantity of CRISPR/Cas9 gene editing by continuous microfluidic electroporation chip

期刊：Bioelectrochemistry（IF:4.8）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2024.108840

CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因组编辑领域具有广泛应用潜力，但该技术在实现大规模细胞编辑时面临挑战，特别是在保持高编辑效率的同时避免细胞损伤。传统的电穿孔方法虽然可以高效地将CRISPR/Cas9传递到细胞中，但通常难以同时保持高细胞存活率和较大数量的细胞处理能力。因此，研究团队开发了连续微流控电穿孔芯片（LaViE-Chip），通过并联多个相对较窄的微流控通道，用两个简单的片外电极实现了细胞流量和电场均匀性之间的令人满意的平衡，同时将电极周围的有害影响与靶细胞隔离开来。同时，通过精心设计微流控通道的曲率，实现了靶细胞的流体动力学控制旋转，以提高转染效率和细胞活力。

通过这些改进，LaViE-Chip实现了71.06%的电转染效率、84.3%的细胞活力和10 7 个细胞/分钟的细胞处理速度，即该方法具有高细胞存活率，高编辑效率和连续操作的优势。此外，还首次成功实现了通过电穿孔进行不间断的CRISPR基因编辑，这一技术创新为未来的大规模基因编辑应用和个性化医疗提供了可能。

2、文章题目：Generation of CRISPR/Cas9 modified human iPSC line with correction of heterozygous mutation in exon 6 of the CaSR gene

期刊：Human Cell（IF:3.4）

原文链接：https://doi.org/10.1007/s13577-024-01135-1

CaSR基因编码钙敏感受体蛋白，该蛋白在体内钙稳态的调节中起关键作用。CaSR基因的突变与家族性低钙尿高钙血症（FHH）等疾病有关。研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CaSR基因的突变进行校正，通过对人类诱导多能干细胞（iPSC）进行基因编辑，生成无突变的细胞系。实验结果显示，研究人员成功在iPSC细胞中修正了CaSR基因第6号外显子的杂合突变，并生成了携带正常CaSR基因序列的细胞系，修复的准确性较高，在编辑后的iPSC中，CaSR基因的表达和钙敏感功能正常，表明基因校正后的细胞能够有效表达功能性CaSR蛋白，验证了基因敲除/修正的成功。该研究为探索钙稳态和相关疾病的个性化药物应用提供了可靠的模型，也为未来基因突变相关的个性化治疗研究提供了新的思路。

（三）CRISPR检测

1、文章题目：Characterization of RNA editing and gene therapy with a compact CRISPR-Cas13 in the retina

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.（IF：9.4）

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2408345121

CRISPR-Cas13系统是一种RNA靶向的基因编辑工具，它避免了永久性基因组编辑带来的潜在风险。由于视网膜细胞对永久性基因编辑可能存在风险，因此研究者们对Cas13 RNA编辑技术产生兴趣，以探索其在非永久性基因治疗中的潜力。研究人员试图开发一种紧凑型CRISPR-Cas13系统，以便更容易地递送到视网膜，并测试其在视网膜细胞中对特定突变基因的编辑效果。

结果显示，紧凑型CRISPR-Cas13系统在体外视网膜细胞模型中展示了高效的RNA编辑能力，成功靶向并修正了特定突变RNA序列，具备有效的RNA编辑能力和良好的特异性，在视网膜疾病的治疗中展现出广泛应用潜力。Cas13系统的紧凑型设计便于递送，也适用于其他基因治疗难以递送的小型目标细胞。该技术通过非永久性RNA编辑为视网膜疾病的治疗提供了安全性更高的策略，同时紧凑的设计和良好的生物相容性使其在实际应用中具有显著潜力。

2、文章题目：Analyte-induced hindrance in the RCA-assisted CRISPR/Cas12a system for homogeneous protein assays

期刊：Analytica Chimica Acta（IF：5.7）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.343294

酶联免疫吸附试验等异质性检测已成为体外诊断不可或缺的方法。然而，由于其多次清洗和孵育步骤以及有限的扩增方法，其简单、灵敏和准确的检测受到限制。因此研究人员设计了一种新方法，利用滚环扩增（RCA）辅助 CRISPR/Cas12a 系统中分析物诱导的阻碍，进行简单且高度灵敏的均质蛋白检测。以链霉亲和素（SA）和地高辛抗体（抗-Dig）为代表性检测模型。使用小分子修饰的引物对目标蛋白的特异性识别阻碍了 RCA 过程，阻止了 Cas12a 反式切割活性的激活，从而导致荧光强度降低。研究人员开发的平台表现出卓越的检测性能，其特点是高灵敏度、强特异性和在复杂样品中应用的巨大潜力。通过扩展识别元素，该平台可以发展成为具有普遍适用性的多功能临床诊断工具。此外，该平台为临床实践中量化超低浓度疾病生物标志物提供了新的方向。

（四）其他CRISPR相关研究

1、文章题目：DTMP-Prime: A Deep Transformer-based Model for Predicting Prime Editing Efficiency and PegRNA Activity

期刊：Molecular Therapy: Nucleic Acid（IF：6.5）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2024.102370

Prime Editors（PE）是基于 CRISPR 的基因组工程工具，具有纠正患者突变的巨大潜力。然而，它们的使用需要对 Prime 编辑向导 RNA（PegRNA）进行实验优化，以实现高编辑效率。伊朗和德国的研究人员开发了一种深度学习模型DTMP-Prime，用于提高对Prime Editing（PE）效率和pegRNA活性的预测。该工具可用于选择最佳的pegRNA和nick gRNA（ngRNA）组合，并准确预测PE实验的效率和结果。

此外，DTMP-Prime 是一种很有前途的工具，可用于精确预测 CRISPR 实验中的脱靶位点。基于 Pearson 和 Spearman 相关系数的评估结果表明，DTMP-Prime 在预测 PE 实验的效率和结果方面优于其他最先进的模型，DTMP-Prime为基因编辑研究提供了重要支持，促进了Prime Editing技术在医学研究和临床应用中的进展。

2、文章题目：RegⅢγ promotes the proliferation, and inhibits inflammation response of macrophages by Akt, STAT3 and NF-κB pathways

期刊：International Immunopharmacology（IF：4.8）

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.intimp.2024.113442

再生基因家族蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）是一种分泌型蛋白质，通常在肠道上皮细胞中表达，在组织损伤和炎症反应中起重要作用，但肝脏RegⅢγ是否对肝脏再生（LR）起重要作用尚不清楚。研究人员通过微阵列分析、qRT-PCR和免疫荧光染色证实了RegⅢγ在LR中的表达谱和定位。然后，分别通过CRISPR/Cas9系统和慢病毒感染获得RegⅢγ缺陷和过表达的RAW264.7细胞。通过MTT、流式细胞术、EdU、transwell、中性红吞噬和NO实验检测RegⅢγ在RAW264.7细胞增殖和炎症中的作用。最后，通过免疫共沉淀和Western印迹实验探讨RegⅢγ的调控机制。

结果表明，在LR过程中，Kupffer细胞中RegⅢγ的表达发生明显变化，过表达RegⅢγ可刺激RAW264.7细胞活力、增殖、吞噬和迁移，而RegⅢγ的缺失则逆转了这些变化。同样，过表达RegⅢγ可促进HO-1和IL-10的表达，而RegⅢγ的缺失则促进NO的产生以及p-Akt、p-STAT3、p-p65和TNF-α的表达。综上所述，在LR的启动阶段，RegⅢγ可能通过促进巨噬细胞增殖，并通过Akt、STAT3和NF-κB通路抑制其炎症反应，从而促进LR。RegⅢγ的发现不仅拓展了对巨噬细胞功能调控的理解，也为炎症性疾病的治疗提供了新的可能。

二、行业新闻

1、Allogene Therapeutics宣布，其基于 TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）基因编辑技术的 CAR-T 候选药物 ALLO-316 最近获得了 FDA 的再生医学先进疗法 (RMAT)称号，用于治疗 CD70 阳性晚期或转移性肾细胞癌 (RCC)。该称号旨在加快有潜力满足严重疾病中未满足的医疗需求的产品的开发和监管审查。

新闻链接： https://ir.allogene.com/news-releases/news-release-details/allogene-therapeutics-receives-fda-regenerative-medicine

2、在最近的 ESGCT 大会上，Precision BioSciences展示了ARCUS 核酸酶在基因插入中的效率，使用AAV6载体在T细胞和肝细胞中实现了超过85%的同源定向修复（HDR）整合。这种靶向插入由 ARCUS 的交错 3' 突出端切割实现，有助于碱基编辑、删除和大型基因组替换。

新闻链接： https://precisionbiosciences.com/wp-content/uploads/2024/10/ESGCT-2024-poster-final42.pdf

艾迪基因专注于CRISPR技术，提供一系列高质量的基因编辑服务和体外诊断产品：CRISPR文库筛选、细胞基因编辑、单克隆筛选、CRISPR检测。致力于为CRISPR相关、基因功能研究相关、体外诊断以及治疗相关的科学研究提供最高效的技术服务。

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