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        神经母细胞瘤（NB）是常见的儿科肿瘤之一，通常发生在儿童的交感神经系统，特别是肾上腺中。尽管一些早期NB病例可以通过手术和化疗治愈，但大多数晚期病例由于肿瘤的生长特性和对常规治疗的抵抗性，导致治疗效果不理想。现如今在癌症的治疗中，免疫治疗法已经在成人癌症的治疗中展现出了显著的效果，其中免疫检查点抑制（ICI）的应用最为广泛。然而研究人员发现，NB的肿瘤细胞通常免疫原性较低，缺乏有效抗原刺激免疫系统，这使得这些肿瘤细胞对免疫检查点抑制（ICI）等免疫疗法的响应并不理想。这一特性使NB成为目前免疫治疗领域中亟待突破的挑战之一。

        为了解决这个问题，研究人员使用CRISPR/Cas9基因敲除技术对小鼠肿瘤细胞中的内质网氨肽酶1（ERAP1）基因进行了敲除。ERAP1的功能是修剪抗原肽，帮助其与主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）结合，从而增强T细胞对肿瘤的识别。将ERAP1敲除后，细胞产生了新抗原，显著提升了其免疫敏感性。为了进一步进行验证，研究人员在敲除细胞中加入了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂Entinostat，观察到MHC I和程序性死亡配体-1（PD-L1）表达增加，T细胞对肿瘤的攻击力明显增强。这表明ERAP1敲除结合Entinostat和程序性死亡蛋白-1（PD-1）阻断疗法显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠细胞的生存期，为人类非免疫原性肿瘤的免疫治疗提供了新思路。该研究发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，题目为“Combining ERAP1 silencing and entinostat therapy to overcome resistance to cancer immunotherapy in neuroblastoma”。

原文链接：https://doi.org/10.1186/s13046-024-03180-y

一、ERAP1的下调对9464D细胞表面MHC I类分子表达没有显著影响

      首先，研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过设计两种单导向RNA（sgRNAs）靶向ERAP1基因的不同外显子区域，对小鼠NB细胞系9464D中的ERAP1进行了敲除，并使用Western blot和基因测序技术确认了敲除成功，该基因的蛋白表达被完全抑制。为了分析其在抗原加工与呈递（APP）通路中的具体作用，特别是其是否影响MHC I类分子的表面表达，研究人员对ERAP1敲除细胞和对照细胞进行了干扰素-γ（IFNγ）处理。IFNγ是一种可诱导MHC I表达的分子。结果显示，敲除ERAP1的9464D细胞在MHC I类分子的表达上未发生显著变化，并且敲除细胞和对照组细胞在IFNγ处理后的MHC I恢复水平上基本一致，表明ERAP1的缺失并不会影响MHC I的诱导表达。此外，通过检测APP通路的其他成分（如TAPBP和β2微球蛋白）以及IFNγ信号通路的关键成分（如IRF1、IRF2和STAT1）的表达水平，结果显示ERAP1的缺失对这些成分的表达造成并没有明显的影响。这些结果表明尽管ERAP1在抗原修饰中具有作用，但其缺失不会显著改变MHC I分子的表面表达或干扰抗原呈递过程，证明ERAP1的抑制或敲除不会妨碍免疫系统识别和攻击肿瘤细胞的能力。

图 1 ERAP1的抑制不影响9464D细胞表面MHC I类分子的表达

二、ERAP1的抑制使9464D细胞更易被免疫细胞裂解

      为了研究ERAP1的敲除对肿瘤细胞的影响，研究人员将敲除ERAP1基因的9464D细胞株命名为sgE-1，并创制了引入不靶向任何基因的sgRNA处理的9464D另一个细胞株sgCTR3作为对照，以确保实验组和对照组的基因编辑过程一致。根据已有研究，ERAP1的沉默会引起的免疫肽组变化，进而影响T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤反应。为了评估sgE-1细胞在激活免疫细胞方面的能力，研究人员将经IFNγ处理和未经处理的sgCTR3和sgE-1细胞系及来源于野生型9464D肿瘤小鼠的脾细胞分别进行了共培养。结果表明，在共培养2小时后，相比sgCTR3，sgE-1吸引了更多的CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和NKT细胞。

      进一步对脾细胞与sgE-1细胞共培养上清液的蛋白质阵列分析显示，与sgCTR3相比，免疫细胞对于相关的趋化因子如CX3CL1和CCL5的吸引增加了两倍以上。此外，sgE-1细胞与脾细胞共培养18小时后，与对照细胞相比，更多的CD8+ T细胞和NK细胞被激活，并且激活标志物的表达显著增加。共培养7小时后sgE-1细胞中caspase 3/7阳性细胞增加。接着进行共培养到24小时后，存活的sgE-1细胞显著少于sgCTR3。这些数据表明，ERAP1的敲除促进了IFNγ释放增加以及T细胞和NK细胞的吸引和激活，使得肿瘤细胞更易被这些免疫细胞裂解清除。

图 2 ERAP1的抑制使9464D细胞更易被免疫细胞裂解

三、ERAP1的缺失在体内抑制9464D肿瘤生长方面效果有限

      研究人员将敲除ERAP1的sgE-1细胞和对照sgCTR3细胞分别植入同系C57BL/6小鼠的左侧腹部，观察肿瘤生长情况并持续监测肿瘤体积变化。结果显示，尽管ERAP1缺失在体外实验中增强了免疫细胞对肿瘤的攻击性，但在体内并不足以有效控制9464D肿瘤的生长。对肿瘤组织中不同免疫细胞群体的比例进行了多色流式细胞术分析，并没有发现免疫细胞浸润差异。这一现象可能是由于9464D肿瘤中MHC I类分子表达水平较低，使得ERAP1敲除所引发的免疫反应未能充分发挥作用，导致其对体内肿瘤生长的抑制效果有限。这一结果暗示，仅靠ERAP1的敲除并不足以激发足够的免疫反应来控制神经母细胞瘤的生长，还可能需要其他手段来进一步提升肿瘤的免疫原性。

图 3 ERAP1的抑制不影响9464D肿瘤的生长和免疫环境

四、ERAP1的缺失影响entinostat诱导的9464D细胞的MHC I类分子表达及其免疫肽组

      通过使用不同浓度的entinostat处理9464D细胞，研究者们发现2μM浓度的entinostat在48小时内可使MHC I类分子表面表达增加至少两倍，并保持细胞活性。进一步的研究结果显示，entinostat能够在对照组sgCTR3和敲除组sgE-1细胞中均诱导MHC I类分子的表达，但缺乏ERAP1的sgE-1细胞中表达水平显著降低。此外，非经典MHC I类分子Qa-1b的表达也在sgCTR3和sgE-1细胞中被诱导，但在sgE-1中的效果较弱，这说明ERAP1可能参与Qa-1b配体生成。然而RAE1和CD86等不与肽结合的分子在sgCTR3和sgE-1细胞中的表达均未受ERAP1缺失的影响，这表明ERAP1对MHC I类分子的作用具有特异性。

      为进一步探究ERAP1对免疫肽组的影响，研究人员对经entinostat处理的sgE-1和sgCTR3细胞进行了质谱分析。通过从H-2Kb和H-2Db分子上纯化并洗脱肽段，鉴定了3419个（8-14个氨基酸）和7776个（9-14个氨基酸）肽段。使用NetMHC-4.0工具预测这些肽段与H-2Kb和H-2Db的结合亲和力，结果显示在sgE-1细胞中，H-2Kb和H-2Db分子的典型肽段长度显著减少，而更长的肽段增加。然而这种差异在sgCTR3和sgE-1共享的肽段中未观察到，该结果进一步支持了ERAP1缺失产生独特免疫肽组的结论。此外，对肽段序列中保守氨基酸分布的分析显示，ERAP1缺失对H-2Kb和H-2Db结合的典型8肽和9肽的组成产生了影响，尤其是H-2Kb结合肽段的P5位点的保守氨基酸模式完全丧失。这些结果表明，H-2Kb和H-2Db呈递的免疫肽组的典型长度和组成对ERAP1依赖性强，在ERAP1敲除细胞中呈现出独特的免疫肽组。

图4 ERAP1的抑制影响经entinostat处理的9464D细胞的MHC I类分子表面表达及其免疫肽组

五、ERAP1的缺失使得entinostat治疗过程中的肿瘤免疫微环境重新编程了，延缓了肿瘤的进展

      为评估entinostat联合ERAP1沉默的体内抗肿瘤效果，研究人员将sgCTR3和sgE-1细胞分别皮下注射到C57BL/6小鼠的腹部。结果显示，entinostat显著抑制了sgE-1肿瘤的进展，但对sgCTR3肿瘤无显著影响，肿瘤进展的减缓显著延长了宿主的生存期。在注射后46天，所有对照小鼠已死亡，而60%的sgE-1肿瘤负载小鼠仍然存活，表明ERAP1缺失使9464D肿瘤对entinostat治疗产生响应。与体外实验相似，entinostat处理显著增加了MHC I类分子的表面表达水平。不仅如此，Entinostat还将NB细胞从肾上腺（ADR）表型转变为更具免疫原性的间充质（MES）表型。免疫组化分析显示，entinostat处理的肿瘤中MES标志物SOX9的表达增加，并与ERAP1的表达无关。此外，对治疗10天后的肿瘤中不同免疫细胞亚群进行分析，发现entinostat处理的sgE-1肿瘤中免疫浸润显著增加，尤其是TILs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞亚群。尽管NK细胞的增加不显著，但整体的免疫细胞浸润得到增强。同时，荧光分析也证实了这些结果，并显示entinostat处理的sgE-1肿瘤中IFNγ和颗粒酶B表达的CD8+ T细胞及表达IFNγ的NK细胞显著增加。这些结果表明ERAP1缺失联合entinostat治疗能够促进炎性T细胞表型的形成，从而实现对神经母细胞瘤（NB）生长的控制。

图5 ERAP1抑制联合entinostat治疗延缓了9464D肿瘤的生长并重塑了肿瘤内的免疫浸润

六、ERAP1缺失联合entinostat和PD-1阻断治疗有效控制肿瘤生长并延长宿主生存期

      先前已有研究表明，entinostat可在多种肿瘤模型中诱导PD-L1表达。在本研究中，entinostat处理后的9464D细胞在体内和体外均表现出PD-L1表达增加，与ERAP1表达水平无关。为了测试entinostat是否能提高PD-1阻断疗效，研究者们将sgE-1和sgCTR3细胞注射到C57BL/6小鼠体内，待肿瘤生长至100 mm³后，将小鼠分为四组：对照组、entinostat单独组、PD-1阻断组以及entinostat和PD-1阻断联合组。结果表明，entinostat对ERAP1缺失的肿瘤疗效更显著，而单独使用PD-1阻断疗法无论是否缺失ERAP1都没有明显的效果。对于小鼠的存活能力进行分析，entinostat联合PD-1阻断在sgE-1肿瘤中的效果明显优于其他治疗方案。对sgCTR3肿瘤小鼠来说，联合治疗的效果与单独使用entinostat相似，40%的小鼠存活；而在sgE-1肿瘤小鼠中，联合治疗显著提高了生存率，46天后所有接受联合治疗的sgE-1肿瘤小鼠仍然存活，相比之下仅有57%接受entinostat单独治疗的小鼠存活。此外，免疫组化分析显示，接受联合治疗的sgE-1肿瘤中CD8+ T细胞浸润明显增加。这些结果表明ERAP1的缺失在增强entinostat和PD-1阻断联合治疗的抗肿瘤效果方面发挥了重要作用，使原本对PD-1阻断无反应的9464D肿瘤模型表现出明显的治疗响应。

      总的来说，以上的结果表明ERAP1在肿瘤免疫调控中具有关键作用，对其进行基因敲除能够增强神经母细胞瘤对免疫疗法的响应性。另外，ERAP1的抑制不仅可以通过上调MHC I类分子和非经典MHC分子的表达来增加肿瘤的免疫原性，还能与entinostat和PD-1阻断疗法联合作用，有效延缓肿瘤生长，显著延长宿主的生存时间。这些发现为非免疫原性肿瘤（如神经母细胞瘤）的免疫治疗提供了新的策略，表明ERAP1可能是未来肿瘤免疫治疗中的潜在靶点，通过调控其活性可以提高肿瘤对免疫疗法的敏感性和治疗效果。

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