人全基因组 CRISPR/Cas9-KO文库和人RNA结合蛋白文库-艾迪基因

【本月之星】人全基因组 CRISPR/Cas9-KO文库和人RNA结合蛋白文库

CRISPR文库筛选是一种基于CRISPR/Cas9技术的高通量基因筛选方案，通过构建包含成千上万个sgRNA的文库，并将这些sgRNA克隆到慢病毒载体中，以低MOI感染靶细胞。这种方法可以确保每个细胞只被一种sgRNA感染，从而实现针对不同sgRNA对应基因的功能筛选。对此，小编为大家推荐艾迪基因畅销的三款文库现货，并附上该文库相关研究文献解读，希望能为大家的科研道路添砖加瓦。

一、MEC全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选助力鉴定调节细胞表面四次跨膜蛋白表达的基因

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112065

四次跨膜蛋白是一个膜蛋白超家族，它们是在寻找哺乳动物癌细胞的新细胞表面抗原时首次被发现的，目前在人类中一共发现了33个四次跨膜蛋白超家族成员，它们被依次命名为TSPAN1~TSPAN33。四次跨膜蛋白介导多种生物过程，包括免疫反应和肿瘤的发育，但目前关于控制它们在细胞表面表达的机制仍不清楚。因此为了确定四次跨膜蛋白转运的调节因子，研究人员对TSPAN8展开了研究。

MEC是一种来源于胆管癌患者的肝癌细胞系，在所有肝癌细胞系中，MEC细胞在mRNA和蛋白水平上表达的TSPAN8水平最高。为了找到影响TSPAN8表达的基因，研究人员对MEC进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。筛选结果显示SPPL3、MGAT1和MGAT2为最具潜力的影响TSPAN8表达的基因。为了验证该基因是否会影响TSPAN8的表达，研究人员使用CRISPR-Cas9基因敲除MGAT1和MGAT2实验和挽救实验的方法进行验证，结果显示MGAT1和MGAT2的敲除明显降低了TSPAN8的表达，且在MGAT1-KO的MEC细胞中重新表达MGAT1能够完全恢复细胞表面TSPAN8的表达。以上结果表明MGAT1、MGAT2基因对TSPAN8的表达有明显的影响。

作者使用MEC全基因组CRISPR-Cas9敲除文库筛选的方法筛选出影响四次跨膜蛋白TSPAN8表达的关键基因，并发现影响其表达的关键途径，为肿瘤侵袭的机制提供了重要参考。

图1 MEC全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，鉴定调控TSPAN8细胞表面表达的基因

二、CRISPR文库筛选技术协助确定了HRP2是多发性骨髓瘤治疗敏感的关键基因

原文链接： https://doi.org/10.1172/JCI149526

多发性骨髓瘤（MM）是一种遗传复杂且异质性的血液系统恶性肿瘤，其特征是恶性浆细胞的单克隆扩增和许多遗传异常，包括染色体易位、缺失、重复和基因突变。HRP2也称为HDGFRP2，是肝瘤衍生生长因子相关蛋白家族的结构相关成员。在癌症细胞中，HRP2主要通过与RNA加工调节分子IWS1相互作用来促进肝细胞癌的细胞生长，然而，HRP2在血液系统恶性肿瘤尤其是在多发性骨髓瘤中的表达、生物学功能和调节机制尚不清楚。

研究人员使用靶向所有人类基因的70290个sgRNA文库进行了全基因组CRISPR/Cas9-KO筛选。通过负选择筛选硼替佐米的耐药基因，通过正选择筛选对硼替佐米敏感的基因。在基因组中扩增sgRNA序列后，通过高通量测序计算细胞中sgRNAs的覆盖率，在敏感细胞中通过正选择发现了28个基因，在抗性细胞中通过负选择发现了15个基因，随后验证了先前建立的对硼替佐米耐药MM细胞中正负选择的前10个基因的表达，确定HRP2是富集基因中差异表达最多的基因。在硼替佐米抗性细胞中，所有靶向 HRP2 的sgRNAs显著增加，RRA算法也证实 HRP2 是最重要的基因之一。之后，为了验证HRP2与 MM 细胞中H3K27me3水平高低的关系，研究人员敲低 HRP2 ，并观察这些必需基因的表达是否增多或减少。结果显示参与 ER 应激相关凋亡途径的一些重要基因上的 H3K27me3 表达升高，说明这些重要基因受到 HRP2 和 H3K27me3的严格调控。这些数据表明，HRP2与临床上MM患者的治疗反应和结果密切相关。

该研究通过人类全基因组CRISPR文库筛选技术，筛选确定HRP2基因是MM对硼替佐米治疗敏感的关键基因，有助于多发性骨髓瘤治疗机制方面的研究，为治疗策略提供新的思路。

图2 体内 CRISPR 文库筛选发现 HRP2 是硼替佐米耐药的关键负调节因子

三、RNA结合蛋白文库助力INTS3基因在大肠癌中的作用研究

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109676

大肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是一种源于结肠或直肠上皮细胞的恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率。研究表明某些RNA结合蛋白（RBPs）对大肠癌（CRC）细胞存活至关重要，其主要作用机制包括：抗凋亡功能、促进肿瘤生长、RNA代谢调控等。为了寻找与CRC相关的基因，研究人员进行了系列研究。

研究人员使用包含了1078个RBPs靶点的的sgRNA文库，在大肠癌（CRC）细胞系中进行CRISPR高通量筛选。目的是通过测定sgRNA丰度的变化，鉴定敲除后显著影响细胞存活或增殖的关键RBPs基因。结果显示，通过CRISPR文库筛选，系统性地筛选出了27个与大肠癌（CRC）细胞存活相关的RBPs，其中INTS3基因相关性最高。为了验证INTS3的功能，实验人员设计了针对该基因的sgRNA，经敲除后发现CRC细胞的凋亡率得到了大幅度提高，同时体内外肿瘤的生长得到了显著抑制，这一结果进一步证实了INTS3对癌细胞存活的关键作用。通过CRISPR-Cas9技术敲除INTS3并结合转录组测序，研究人员发现其通过调控抗凋亡基因（如TXNIP、CLU和NR4A1）mRNA的稳定性，增强了CRC细胞的存活能力。

研究结果不仅对RBPs在大肠癌中功能进行了深入的探究，还为癌症的精准治疗提供了新的靶点和策略。CRISPR文库筛选技术凭借其高通量、特异性和高效性的优势特点，成为了解析基因功能网络和识别关键治疗靶点的前沿工具，为精准医学研究提供了重要支撑。