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CRISPR那些事儿
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FAQ
如何选择合适的基因递送方式？
选择适合的基因传递系统需要根据具体实验条件、研究目的以及细胞类型等因素综合评估。定量比较各种系统的传递效率、细胞毒性和稳定性等是进一步明确选择的重要步骤。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
一般CRISPR相关试剂以及Cas蛋白可以存放多久？
CRISPR检测相关试剂：
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
Cas9、Cas12和Cas13三者之间有什么区别？
Cas9、Cas12和Cas13三者的主要区别在于作用过程有差异：
Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。
Cas12与guide RNA、target DNA结合后会被激发针对ssDNA的反式剪切活性；Cas13与guide RNA、target RNA结合后会被激发针对ssRNA的反式剪切活性；而Cas9暂未被报道反式剪切活性。
dsDNA靶标和ssDNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性吗？哪种效率更高？
双链DNA靶标和单链DNA靶标均能激活Cas12a的反式剪切活性(trans-cleavage，又名collateral cleavage)，这点与Cas12b相同。但不同的是，ssDNA靶标激发Cas12b反式活性的效率高于dsDNA靶标；而dsDNA靶标激发Cas12a反式活性的效率高于ssDNA靶标。
如何提高Cas酶的检测灵敏度？
1）设计高效的crRNA序列。通过合理的设计以及在线网站结构预测，选择合适的crRNA,以获得良好的Cas酶反式切割活性。
2）选择合适的信号报告底物。有关研究指出，使用15 nt的单链DNA（ssDNA）作为报告底物时，Cas12a的切割反应速率达到最大值，相较于常用的5-nt ssDNA，反应速率显著提升。
3）优化反应条件和缓冲液。通过优化CRISPR反应的条件如Cas酶与crRNA比例、Cas酶使用浓度、反应温度等可以在一定程度上提高检测效果。
2）选择合适的信号报告底物。有关研究指出，使用15 nt的单链DNA（ssDNA）作为报告底物时，Cas12a的切割反应速率达到最大值，相较于常用的5-nt ssDNA，反应速率显著提升。
3）优化反应条件和缓冲液。通过优化CRISPR反应的条件如Cas酶与crRNA比例、Cas酶使用浓度、反应温度等可以在一定程度上提高检测效果。
如何设计crRNA？
可根据以下步骤进行设计
1）明确目的基因序列。
2）明确使用的Cas蛋白。不同的Cas蛋白，需要识别相应的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，例如Cas12a需要依靠“TTTV”PAM序列进行靶标识别。
3）选择crRNA靶向区域。在目标基因上选择一个20nt核苷酸序列，该序列紧邻PAM位点，且与crRNA的互补链配对。
4）选定的20nt靶向区域作为 target sequence（可变部分）加上scaffold sequence （固定部分）以设计crRNA序列。
5）使用在线工具如CRISPR design tool（例如CRISPOR、 Benchling等）来帮助设计crRNA。这些工具可以预测sgRNA的效率和特异性，避免可能的脱靶效应。
6）设计完成后，可以通过合成生物学公司订购合成的crRNA序列。
1）明确目的基因序列。
2）明确使用的Cas蛋白。不同的Cas蛋白，需要识别相应的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，例如Cas12a需要依靠“TTTV”PAM序列进行靶标识别。
3）选择crRNA靶向区域。在目标基因上选择一个20nt核苷酸序列，该序列紧邻PAM位点，且与crRNA的互补链配对。
4）选定的20nt靶向区域作为 target sequence（可变部分）加上scaffold sequence （固定部分）以设计crRNA序列。
5）使用在线工具如CRISPR design tool（例如CRISPOR、 Benchling等）来帮助设计crRNA。这些工具可以预测sgRNA的效率和特异性，避免可能的脱靶效应。
6）设计完成后，可以通过合成生物学公司订购合成的crRNA序列。
什么是基因过表达？
基因过表达指的是通过各种技术手段使某个特定基因在细胞或生物体中表达水平显著高于正常水平。这通常是通过引入额外的基因拷贝或使用强启动子驱动基因表达来实现的。
如何选择合适的细胞进行文库筛选？
细胞选择可以遵循以下原则：
1）与研究目的相符
2）sgRNA文库靶向的基因要与细胞的属源相符
3）细胞可以稳定传代
4）转染效率高
尽量不选用原代细胞。由于原代细胞无法稳定传代，可能在文库筛选实验的过程中，原代细胞已经出现大量死亡，无法完成实验。如果选用原代细胞进行文库筛选，为了解决上述的风险，可以通过降低细胞覆盖度和选择gRNA数较小的文库进行筛选，尽可能降低文库细胞池的数量和缩短实验周期。
1）与研究目的相符
2）sgRNA文库靶向的基因要与细胞的属源相符
3）细胞可以稳定传代
4）转染效率高
尽量不选用原代细胞。由于原代细胞无法稳定传代，可能在文库筛选实验的过程中，原代细胞已经出现大量死亡，无法完成实验。如果选用原代细胞进行文库筛选，为了解决上述的风险，可以通过降低细胞覆盖度和选择gRNA数较小的文库进行筛选，尽可能降低文库细胞池的数量和缩短实验周期。
艾迪基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
What are the potential applications of iPSCs in clinical practice?
iPSCs have broad clinical potential, including applications in cell therapy (e.g., for diabetes or heart disease treatment), tissue engineering (e.g., development of artificial skin or liver tissue), and personalized drug screening (e.g., selecting optimal treatments based on a patient’s specific cellular response). These applications may transform treatment methods, offering more effective and personalized medical services.
What are induced pluripotent stem cells (iPSCs)?
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are cells reprogrammed from adult cells to a pluripotent state. They exhibit similar characteristics to embryonic stem cells, capable of differentiating into nearly all cell types in the body. This technology allows scientists to generate various cell types in vitro for research and therapy without the need for embryonic stem cells.
What is the difference between iPSCs and embryonic stem cells (ESCs)?
Both iPSCs and embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent, but iPSCs are derived from reprogrammed somatic cells, while ESCs originate from early embryos. iPSCs do not involve embryo use, making them a more ethically acceptable choice, and they also avoid immune rejection issues, as they can be generated based on a patient’s genetic background.
How do iPSCs help us understand complex diseases?
Cells from patients are isolated and reprogrammed into iPSCs, which are then induced to differentiate into specific cell types to create disease models. These models enable researchers to study disease mechanisms, uncover disease-related genes, and molecular pathways, thereby advancing the development of new therapies. By analyzing these cells, scientists can observe disease-related changes at the cellular level, providing new perspectives in disease research.
What role does gene knock-in play in drug development?
Gene knock-in plays a crucial role in drug development. It is used in target validation by introducing specific genes into cell lines or animal models to confirm drug target efficacy. It also aids in establishing disease models, testing drug efficacy and safety in these models, and supporting drug screening through high-throughput screening in knock-in cell lines to identify potential drug candidates. Additionally, gene knock-in helps uncover drug mechanisms, optimize drug structure, and improve dosing strategies, expediting drug development while enhancing efficacy and safety.
What is the core principle of gene knock-in technology?
Gene knock-in technology involves inserting an exogenous gene sequence into a specific location within the genome for gene function studies or disease treatment. Edigene utilizes advanced gene editing tools, such as the CRISPR/Cas9 system, to guide nucleases to cut the target DNA, and employs homology-directed repair or non-homologous end joining to accurately insert the gene at the desired location, achieving efficient and precise gene knock-in.
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